兔声带成纤维细胞的体外培养、示踪与声带瘢痕的研究

摘要

正常声带组织因外伤或疾病损伤后所形成的纤维组织替代产物形成了声带瘢痕。由于瘢痕组织使声带变得坚硬，影响了声带固有层的粘弹性（viscoelastic strength），改变了声带的生物力学特性，从而减弱声带振动黏膜波的产生而影响发声。目前，尚未找到一种理想的预防和治疗声带瘢痕的方法。近年来，组织工程学技术在组织器官重建方面取得了令人瞩目的进展，其主要原理是以少量种子细胞经体外扩增后与生物材料、细胞因子结合，修复较大的组织或器官缺损，重建组织器官的生理功能，最终达到完美的形态甚至功能修复的目的。将组织工程学的技术方法应用于喉科，有望在未来实现声带，甚至喉的再生。人类的声带组织是一个高度分化的分层结构，从组织学结构上可分上皮层、固有层和肌肉层（甲杓肌）。声带固有层又分为固有浅层（Reinke’s层），固有中层和固有深层。这种分层在描述声带结构功能方面具有重要意义。固有层是声带最重要的特征性结构，主要包括细胞及细胞外基质成分。组成固有层的细胞为数较少，主要细胞有：成纤维细胞，肌成纤维细胞和巨噬细胞。成纤维细胞是维持固有层结构与功能的重要细胞，主要分布在固有层深层，其调控细胞间质的沉着、降解及重新分布；细胞外基质成分包括纤维蛋白和间隙蛋白。
　　 本研究第一部分我们首先制作了兔声带瘢痕模型，并对声带瘢痕进行初步研究。在支撑喉镜下，用喉钳夹取双侧声带前中部组织（未达肌层），未手术者作为正常对照，1个月后处死动物，收获声带组织，采用Masson三色染色观察声带胶原，采用经过透明质酸酶处理的Alcian blue染色观察透明质酸。利用Image-Pro Plus 6.0软件进行对切片染色进行半定量分析，实验结果表明瘢痕声带的胶原成分明显增多，透明质酸含量无明显改变。
　　 本研究中，我们对声带固有层的组织工程学再生进行了初步探索。组织工程学的三个要素是种子细胞，支架材料，和细胞因子。本研究第二二部分首先进行了种子细胞-兔声带成纤维细胞（vocal fold fibroblasts，VFFs）的体外培养。取兔声带组织，消化法获取成纤维细胞，用含有胎牛血清的高糖DMEM培养基体外培养，摸索出最佳培养条件。在倒置相差显微镜下观察细胞的形态及生长状况，并经过传代使细胞纯化。利用免疫组化方法，检测成纤维细胞的特异性蛋白Vimentin，结果Vimentin阳性率90％以上，证明所培养的细胞为成纤维细胞，且阳性率较高。
　　 本研究第三部分观察培养的细胞在异体生物体内相容性及生长情况。我们对培养的细胞进行Ad-EGFP标记。取新西兰兔6只，随机选取2只兔作为无干预组，4只新西兰兔做双侧声带急性损伤模型，左侧声带损伤部位注射104个/ml浓度的Ad-EGFP标记的细胞混悬液，向右侧声带损伤部位注入生理盐水1ml作为对照。声带注射细胞后，兔生长情况良好，均未发生感染、喉水肿，免疫排斥等反应。15天后收获声带组织，荧光显微镜下观察未发现成活的VFFs。说明单纯VFFs注射到异体组织很难存活，为其在动物体内生长提供生长支架可能会利于生长。
　　 总之，本研究对声带组织工程学进行了初步探索，制备了种子细胞，探索了种子细胞体内相容性，制备了声带瘢痕动物模型，在后续的研究中，我们将构建细胞-支架材料复合物，移植入声带瘢痕模型，观察声带再生修复情况。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

英文缩略词表

前 言

第一部分 声带癜痕的研究

材 料

方法

结 果

讨 论

第二部分 兔声带成纤维细胞的体外培养、传代、鉴定与示踪

材 料

方法

结 果

讨 论

第三部分 同种异体成纤维细胞体内相容性实验

材 料

方法

结 果

讨 论

总结与展望

参考文献

文献综述

参考文献

个人简历

致 谢