高半胱氨酸61(Cyr61/CCN1)及相关分子在胃癌中的表达及其与预后的关系

摘要

目的
　　 胃癌(Gastric Cancer，GC)是消化道最常见的恶性肿瘤。目前临床上缺乏辅助早期诊断、指导治疗及监测预后的理想分子标志物。寻找有效的分子标志物成为胃癌研究的热点。北京肿瘤分子生物学实验室前期建立了胃癌、癌旁及正常胃黏膜组织的基因表达谱，得到一组正常胃黏膜与胃癌及癌旁组织的差异表达基因，其中高半胱氨酸61细胞外基质蛋白(cysteine-rich61，Cyr61/CCN1)在胃癌及癌旁组织中均呈高表达，均高于正常胃黏膜组织，且Cyr61在肠型胃癌和弥漫型胃癌中的表达有差异，本研究应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测Cyr61在人胃癌细胞系、新鲜胃癌组织样本中的表达水平，初步验证了表达谱的结果。近年来，胃癌的发病率和死亡率逐渐下降，但青年人胃癌和食管胃交界腺癌(Adenocarcinoma of theoesophagogastric junction，AEG)患者却明显增多，且二者都有其独特的临床、病理特点，预后也较差.目前关于这两种特殊类型胃癌的深入研究还很少。因此我们从胃癌病例数据库中选择了这样两组特殊人群和类型进行Cyr61与胃癌关系的系列研究，期望能够明确Cyr61在青年人胃癌和食管胃交界腺癌的诊断、分型和/或预后判断中的作用.此外，本研究以4种人胃癌细胞系为研究对象，应用实时定量PCR(Real-Time PCR)技术检测成熟体microRNA(hsa-miR-142-5p)及其预测靶基因Cyr61表达的相关性，非常初步地探讨了可能调控Cyr61异常表达的机制。
　　 材料方法
　　 收集中国人民解放军总医院病理科1996年1月1日至2005年12月31日的306例胃癌病例，其中青年人胃癌128例，食管胃交界腺癌191例(13例为重复病例)，制作成组织芯片；121例青年人胃癌和54例食管胃交界腺癌获得随访结果。收集10例新鲜胃癌组织标本，其中5例包括癌(T)和癌旁组织(P)及配对正常组织(N)，另5例包括癌(T)和配对正常组织(N)。采用免疫组织化学染色(EnVsion二步法)检测可能与Cyr61相关的CD44、CDX2、β-catenin，PTEN，MMP9，HER1和HER2蛋白在两组胃癌中的表达差异；通过培养并提取6种人胃癌细胞系BGC823、MGC803、SGC7901、AGS、N87和MKN45，以及10例新鲜胃癌组织标本中的RNA，以RT-PCR技术检测Cyr61的表达水平；细胞免疫荧光检测Cyr61蛋白在人胃癌细胞系BGC823争MGC803中的表达及定位情况；以荧光原住杂交(Fluorescence insitu hybridization，FISH)技术检测HER2在青年人胃癌及食管胃交界腺癌中的扩增情况；在Cyr61异常表达的原因分析方面，以Real-Time PCR技术检测Cyr61及相关成熟体nucroRNA(hsa-nuR-142-5p)在人胃癌细胞系BGC823、SGC7901、AGS和MKN45中的表达水平.采用SPSS13.0统计软件，对上述数据进行Kaplan-Meier生存分析、COX风险比例模型构建、Spearman相关分析两变量之间的关系，设P<0.05具有统计学意义。
　　 结果
　　 青年人胃癌病例的年龄分布为19～40岁，平均年龄为35.6岁，中位年龄为36岁；其中男性患者84例，女性患者44例，男女比例为1.91：1。食管胃交界腺癌病例的年龄分布为28～83岁，平均年龄为59.7岁，中位年龄为60岁；其中男性患者170例，女性患者21例，男女比例为8.1：1。青年人胃癌患者的生存时间为3.4～127.2个月，中位生存时间为24个月；食管胃交界腺癌患者的生存时间为3～86个月，中位生存时间为31个月。
　　 影响青年人胃癌患者生存率的因素有性别，脉管癌栓，嗜酸性粒细胞浸润，肿瘤浸润深度，肿瘤最大径，淋巴结转移，远处转移和临床分期；影响食管胃交界腺癌患者生存率的因素有肿瘤浸润深度，淋巴结转移和临床分期。COX生存分析显示肿瘤浸润深度越深(P=0.0076)、伴有淋巴结转移(P=0.0368)和远处转移(P=0.0156)的青年人胃癌患者预后差；食管胃交界腺癌中，肿瘤浸润深度越深(P=0.0458)，伴有淋巴结转移(P=0.0389)的患者预后差。
　　 通过RT-PCT检测6种人胃癌细胞系，结果分析Cyr61存在差异表达，于BGC823中表达最高，AGS中最低。在新鲜配对胃癌组织中，Cyr61的mRNA在正常组织中呈低表达趋势，而在胃癌和癌旁组织中有不同程度的上调，与基因表达谱结果一致。Cyr61蛋白定位于胃癌细胞的胞浆，在青年人胃癌组中，Cyr61蛋白的表达水平与性别、WHO分型，Lauren分型、临床分期，肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移均有关，其阳性表达率随肿瘤临床分期增加而增加；在食管胃交界腺癌组中，Cyr61蛋白的表达水平与临床分期、肿瘤浸润深度有关，Cyr61蛋白阳性患者和阴性患者的预后差别有统计学意义(P=0.0001)。
　　 在青年人胃癌组中，Cyr61和β-catenin、MMP9及HER2的表达具有相关性(P分别为0.0009、0.0000和0.0000)；β-catenin阳性患者的生存率比β-catenin阴性患者的生存率低(P=0.0314)，PTEN阳性患者的生存率比PTEN阴性患者的生存率高(P=0.0216)，MMP9阳性患者的生存率比MMP9阴性患者的生存率低(P=0.0112)；在食管胃交界腺癌组中，Cyr61和MMP9的表达具有相关性(P=0.0368)，MMP9阳性患者的生存率比MMP9阴性患者的生存率低(P=0.0451).COX生存分析显示：青年人胃癌组中，MMP9、CD44高表达的患者预后差(P分别为0.0037和0.0006)；食管胃交界腺癌组中，MMP9、Cyr61高表达的患者预后差(P分别为0.0074和0.0004)。
　　 hsa-miR-142-5p与Cyr61的相对表达量之间存在负相关性，相关系数为-0.9926(P=0.007)。
　　 结论
　　 1.Cyr61在胃癌细胞系BGC823，MGC803和SGC7901中高表达，在AGS中低表达；在新鲜胃癌和癌旁组织中的mRNA表达水平均高于正常胃黏膜组织。Cyr61定位于胃癌细胞的胞浆，在青年人胃癌和食管胃交界腺癌中均呈高表达。
　　 2.青年人胃癌中，Cyr61在肠型胃癌比弥漫型胃癌表达高，其表达与临床分期呈正相关，临床分期越晚，Cyr61表达越高；Cyr61的表达与β-catenin、MMP9和HER2的表达具有相关性；单因素分析，β-catenin、MMP9阳性、PTEN阴性的患者预后比β-catenin、MMP9阴性、PTEN阳性的患者预后差。多因素分析，MMP9、CD44高表达的患者比低表达的患者预后差。
　　 3.食管胃交界腺癌中，Cyr61的表达与临床分期呈正相关，临床分期越晚，Cyr61表达越高；Cyr61阳性表达的患者预后差。单因素分析，MMP9阳性的患者的生存率比MMP9阴性患者的生存率低。多因素分析，MMP9、Cyr61高表达的患者比低表达的患者预后差。
　　 4.青年人胃癌的特点是弥漫型胃癌所占比例高，女性更易患弥漫型胃癌，且预后更差。单因素分析影响青年人胃癌预后的因素有性别，嗜酸性粒细胞浸润，脉管癌栓，肿瘤浸润深度，肿瘤最大径，淋巴结转移，远处转移和临床分期；多因素COX风险比例模型中，影响因素有肿瘤浸润深度，淋巴结转移和远处转移。
　　 5.食管胃交界腺癌的特点是男性高发，组织学分型以管状腺癌最常见。单因素分析影响食管胃交界腺癌预后的因素有肿瘤浸润深度，淋巴结转移和临床分期；多因素COX风险比例模型中，肿瘤浸润深度和淋巴结转移成为入选因素。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分 胃癌病例基本临床病理信息的分析

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 Cyr61/CCN1在胃癌中的异常表达

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 多种分子标志物在胃癌中的表达及与Cyr61的相关性分析

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结

参考文献

文献综述 Cyr61与胃癌的研究进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢

个人简历