抗前列腺癌可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3的基础研究

摘要

背景与目的：
　　 人前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）高表达于进展期前列腺癌组织及前列腺癌转移灶，与前列腺癌发生、发展密切相关，在前列腺癌诊断和治疗研究中备受重视。本研究选择人PSCA作为免疫治疗的靶点，以塞姆利基森林病毒（Semliki Forest Virus，SFV）复制子载体pSCK为基础，构建用于治疗前列腺癌的可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3，同时为评价疫苗的免疫功能，在大肠杆菌BL21系统中表达和纯化了人PSCA的融合蛋白，构建了可以高效表达人PSCA的小鼠B16细胞系.本研究为pSCK-PSCA3疫苗的免疫功能评价奠定了坚实的实验基础，也为前列腺癌的免疫治疗提供了一种全新策略。
　　 方法：
　　 （1）利用DNA重组技术将PSCA片段克隆入含有GST标签的原核表达载体pET42a，双酶切鉴定后得到正确的重组质粒pET42a-PSCA，转化大肠杆菌BL21后，IPTG诱导表达，用Glutathione Sepharose 4B柱对诱导蛋白进行纯化，纯化产物进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定；
　　 （2）利用PCR扩增人PSCA全长基因的cDNA编码区序列，插入到真核表达载体pcDNA3.1中，双酶切及测序鉴定后得到正确的重组质粒pcDNA3.1-PSCA。利用脂质体法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞，G418加压筛选后得到阳性克隆。通过流式细胞术、免疫荧光及Western Blot检测PSCA在细胞系中的表达情况；
　　 （3）将sig-PSCA3-Fc-GPI-GM/B7基因片段自pVAX1-PSCA3-FcGB质粒上切下，插入可复制型载体pSCK中，构建可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3，并应用流式细胞术及免疫组化鉴定其在真核细胞中的表达情况。
　　 结果：
　　 （1）pET42a-PSCA原核表达质粒构建正确，SDS-PAGE及Western Blot检测显示GST-PSCA融合蛋白诱导表达成功，分子量大小约为43KD。
　　 （2）pcDNA3.1-PSCA真核表达质粒构建正确，建立了稳定转染人PSCA的B16细胞系，其表达率接近100％。
　　 （3）成功构建了可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3，流式细胞术及免疫组化检测证明该疫苗可以在真核细胞中有效表达。
　　 结论：
　　 在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了PSCA融合蛋白，筛选出的B16细胞系可以高效表达PSCA基因，成功构建了可复制型PSCA基因疫苗pSCK-PSCA3，为后续肿瘤疫苗的体内外免疫功能研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

前 言

1、DNA 疫苗的免疫学机制

2、可复制型疫苗载体系统的特性和优势

3、选择 PSCA 作为免疫治疗靶抗原的优势

第一部分 PSCA 融合蛋白的原核表达及纯化

材料与方法

结果

讨论

第二部分 稳定转染人 PSCA 的 B16 细胞系的建立

材料与方法

结果

讨论

第三部分 可复制型 DNA 疫苗 pSCK-PSCA3 的构建及表达

材料与方法

结果

讨论

总 结

参考文献

综述

参考文献

附录：英文缩略词表

攻读学位期间发表文章

致谢