大鼠牙源性细胞复合Nhac/PLA形成牙体组织-骨复合体样结构及ADAM28基因作用的研究

摘要

种子细胞、生物支架、生长因子和微环境并称为组织工程的四要素。组织工程牙是将从成牙组织中分离的生物活性细胞“种植”到载体支架上,并提供细胞增殖和分化的生长因子微环境,在体外或体内植入形成有活性的牙齿样结构和牙齿。制备适宜的支架材料,寻找种子细胞培养的最优条件,探索最佳的生长因子或生长因子组合,是组织工程牙研究的方向。生长因子的开发和合理运用是促进种子细胞再生潜力发挥的重要因素之一,现今国内外有关生长因子单独作用于细胞.支架复合体的研究比较普遍,但两种或多种因子复合应用的效果尚未见详细报道.纳米羟基磷灰石-胶原/聚乳酸(nanometer hydroxyapatite-collagen/polylactic acid,nHAC/PLA)生物支架是仿生纳米级植骨材料,具有良好的组织相容性、优异的生物活性、高效的骨诱导性及可降解性.本研究首次将不同组合生长因子bFGF+IGF1、TGF-β1+BMP4、bFGF+IGF1+TGF-β1+BMP4分别诱导大鼠牙源性上皮细胞(rDECs)、间充质细胞(rDMCs)后分层接种于nHAC/PLA三维支架上,移植入免疫缺陷小鼠体内,以诱导形成牙体组织-骨复合体样结构,并对其进行鉴定分析,期望为颌骨缺损及牙齿缺失的再生修复提供可行性依据。
　　 牙齿发育是两种相邻组织-外胚上皮和神经嵴来源的间充质相互作用的结果,呈时空变化的基因调控在牙胚发育过程中发挥关键作用,调控细胞的增殖、分化和凋亡,决定牙胚的发育进程。金属蛋白酶解离素28(a disintegrin andmetalloprotonase28,ADAM28)是定位于细胞表面、拥有蛋白水解和黏附特性且具备自身催化活性的的跨膜分泌型糖蛋白,是从先天性牙根发育不良(congenitalhypoplasia of tooth root,CHTR)患者的差异表达基因中筛选出来的可能致病基因之一,有关其在牙源性间充质干细胞中的表达分布及作用机理尚未见报道。本研究应用免疫学、细胞生物学和分子生物学技术,对ADAM28在人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,HPDLSCs)、人牙髓干细胞(human dentalpulp stem cells,HDPSCs)中的分布特征及对两类细胞生物学特性的影响及可能的调控机制进行了初步探讨。全文共分三部分,主要研究内容和结果如下:
　　 第一部分大鼠牙源性细胞复合nHAC/PLA支架体内形成牙体组织-骨复合体样结构的研究
　　 目的:探讨经不同组合生长因子诱导的大鼠牙源性上皮细胞、间充质细胞复合nHAC/PLA支架体内形成牙体组织-骨复合体样结构的能力。
　　 方法:
　　 1.应用酶消化法和差速消化法分离培养大鼠牙源性上皮细胞((rat dental epithelialcells,rDECs)和牙源性间充质细胞(rat dental mesenchymal cells,rDMCs),经cytokeratin、vimentin免疫荧光染色鉴定其来源。
　　 2.应用组织学染色(茜素红、ALP钙-钴法)检测矿化液诱导下rDMCs的成骨特性。应用免疫组化染色、Real-time PCR和western blot检测rDMCs在不同组合因子bFGF+IGF1(组①)、TGF-β1+BMP4(组②)、bFGF+IGF1+TGF-β1+BMP4(组③)诱导下CAP、DSPP、OCN、OPN的表达差异。
　　 3.应用四唑盐比色法(MTT)检测不同因子组合诱导后rDMCs的增殖活性,酶动力学法检测总蛋白和ALP值,罗式诊断分析法和放射免疫分析法分别检测rDMCs上清液内钙、磷和骨钙素浓度。
　　 4.应用扫描电镜观测rDECs、rDMCs分层复合nHAC/PLA支架后的生物相容性.
　　 5.将各组细胞-支架复合物移植裸鼠皮下3月、5月后分别取材,应用H&E、甲苯胺蓝、Goldner三色和免疫组化染色检测移植物形成牙体组织.骨复合体样结构的能力。
　　 结果:
　　 1.成功分离培养、鉴定大鼠牙源性上皮细胞和问充质细胞,经矿化液诱导后的rDMCs钙结节和ALP染色阳性.组①、②中CAP、OCN、DSPP、OPN mRNA和蛋白的表达水平均显著高于空白对照组④(未加因子的DF12培养液),其中组①CAP、OCN和组②DSPP、OPN的表达水平最高。
　　 2.组①的OD值在第4d、7d显著高于其他3组,并在第4d达到峰值。组①、②、③在第7d的总蛋白和ALP值均显著高于对照组④,以组②表达最高。4组的钙、磷浓度均在第10d达最高值,在各时间点,组①的钙、磷浓度显著高于其他3组。组②的骨钙素(OCN)在第4d达到峰值,同时4组均在第7d达最低值,其中组③在第7d的骨钙素含量最低。
　　 3.扫描电镜显示:rDECs、rDMCs复合nHAC/PLA共培养5d后,椭圆形的rDECs和长梭形的rDMCs胞体充分伸展,胞质中胶原纤维和基质分泌丰富,细胞与支架相互交织成网状。10d后,rDECs、rDMCs胞质中基质分泌更加丰富,覆盖部分细胞,并与支架相融合。
　　 4.细胞-支架复合物移植后3月,组①、②、③在细胞.支架接触部位均发现类骨质、新生成熟骨和血管形成,并有OCN、OPN的阳性表达。组②TGF-β1+BMP4的促成骨作用最强,可见布满骨髓基质细胞的骨髓腔。空白对照组④没有新生骨形成,仅有少量胶原纤维和血管。移植后5月,组①、③均形成没有髓腔的牙根样结构,部分区域有DSPP、DMP1、CAP的表达。组②形成周边有新生骨、中央有单根牙体样组织,内有髓腔样结构(含有牙髓样组织和血管),并有DSPP、DMP1、OPN、OCN在髓腔内壁牙本质基质、部分牙髓样组织和血管内的阳性表达,ameloblastin、CAP分别在釉质样、牙骨质样组织中表达阳性。空白对照组④形成新生骨,并有OCN的强阳性表达,但未见形成牙体样结构。
　　 结论:
　　 1.rDMCs经矿化液诱导后具有成骨特性。组①bFGF+IGF1可显著促进rDMCs的增殖活性(第4d)和CAP、OCN的表达,加速rDMCs向成牙骨质细胞、成骨细胞的分化和基质矿化(第4d),升高细胞外液的钙、磷离子浓度(第10d).组②TGF-β1+BMP4能显著提高OCN、DSPP、OPN的分泌水平(第4d),促进rDMCs的总蛋白合成和ALP活性(第7d),提示TGF-β1+BMP4可加速rDMCs向成骨细胞、成牙骨质细胞、成牙本质细胞分化与骨基质、牙本质基质的矿化,显示其成骨趋向.组③则显著抑制OCN的分泌(第7d),降低rDMCs向成骨细胞的分化速度,提示4种因子之间并不具备显著的协同作用。
　　 2.rDECs+rDMCs复合nHAC/PLA支架后增殖、分化旺盛,生物相容性良好。
　　 3.经TCF-β1+BMP4诱导的rDECs+rDMCs-nHAC/PLA体内移植物的促成骨和成牙作用最强,移植后5月形成了牙体组织-骨复合体样结构。
　　 第二部分 ADAM28基因对人牙周膜干细胞增殖、分化和凋亡特性的影响
　　 目的:探讨ADAM28对人牙周膜干细胞(HPDLSCs)增殖、分化、凋亡等生物学特性的影响和可能的作用机制.
　　 方法:
　　 1.利用酶联合消化法(typeⅠcollagenase+dispase)原代培养人牙周膜成纤维细胞,间接免疫磁珠法加以分离纯化,经免疫荧光染色鉴定HPDLSCs的来源。
　　 2.应用基因重组技术构建并鉴定ADAM28真核表达质粒,经脂质体介导转染HPDLSCs48h后,应用免疫荧光、RT-PCR和western blot检测ADAM28在HPDLSCs中的表达水平。
　　 3.将经过全硫代修饰及FITC荧光标记的ADAM28反义核酸(antisenseoligodeoxynucleotide,AS-ODN)及和正义对照S-ODN转染HPDLSCs48h后,应用免疫荧光、RT-PCR和western blot检测转染效率和封闭效率。
　　 4.将成功构建的ADAM28真核表达质粒、空载体pcDNA3.1(+)、AS-ODN、S-ODN同时转染HPDLSCs,应用四唑盐比色法(MTT)、流式细胞术(flow cytometry,FCM)、酶动力学法、免疫细胞化学和western blot研究各组对HPDLSCs增殖、分化、凋亡的影响并分析可能的作用机制。
　　 结果:
　　 1.成功获得STRO-1(+)的HPDLSCs,证明是来源于中胚层的间充质干细胞。
　　 2.成功克隆ADAM28基因的编码区全长2327bp,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ADAM28；并经酶切鉴定、PCR鉴定和核苷酸序列分析正确无误。将ADAM28真核质粒转染HPDLSCs48h后,细胞胞质强阳性表达ADAM28蛋白,可与抗ADAM28蛋白的抗体发生特异性结合,在转录和蛋白水平证明ADAM28在HPDLSCs内能被正确地翻译、表达。
　　 3.ADAM28 AS-ODN的转染效率和封闭效率较高,可有效抑制HPDLSCs内ADAM28 mRNA和蛋白的表达。
　　 4.ADAM28真核质粒转染后可显著促进HPDLSCs的增殖并抑制其分化,ADAM28AS-ODN则显著抑制HPDLSCs的增殖并促进其分化,下调HPDLSCs内CAP的表达水平并诱导HPDLSCs的凋亡.
　　 结论:ADAM28真核表达质粒通过激活ADAM28基因的类金属蛋白酶功能域,发挥其金属蛋白酶的催化活性,裂解基质蛋白、改建组织结构,有效调控细胞的增殖和分化.ADAM28 AS-ODN通过参与细胞凋亡副反馈机制,并与其它调控基因、基质蛋白等协同作用,平衡细胞的增殖、分化和凋亡.
　　 第三部分 ADAM28基因对人牙髓干细胞生物学功能的影响
　　 目的:探讨ADAM28基因对人牙髓干细胞(HDPSCs)生物学功能的影响和可能的调控机制。
　　 方法:
　　 1.应用酶联合消化法(typeⅠcollagenase+dispase)原代培养人牙髓细胞,间接免疫磁珠法分离纯化,经免疫荧光染色鉴定HDPSCs的来源。
　　 2.将ADAM28真核质粒、AS-ODN转染HDPSCs48h,经免疫荧光、RT-PCR和western blot检测转染效率和各组ADAM28的表达水平.
　　 3.采用MTT、FCM、酶动力学法、免疫细胞化学和western blot检测ADAM28真核质粒、AS-ODN对HDPSCs增殖、分化和凋亡的影响。
　　 结果:
　　 1.成功获得STRO-1(+)的HDPSCs,证明是来源于中胚层的间充质干细胞。
　　 2.ADAM28真核质粒转染HDPSCs48h后,获得了具有生物学活性的ADAM28真核表达产物,在转录、翻译和蛋白水平证明ADAM28在HDPSCs内能被正确地表达.ADAM28 AS-ODN能显著促进HDPSCs内ADAM28 mRNA和蛋白的表达,发挥明显的负向调控作用。
　　 3.ADAM28真核质粒能显著提高HDPSCs内ALP和DSPP的分泌活性,即促进HDPSCs多向分化和基质矿化,抑制HDPSCs的增殖并诱导其凋亡。ADAM28AS-ODN则显著促进HDPSCs的增殖并抑制其分化。
　　 结论:ADAM28参与HDPSCs增殖、分化、凋亡的网络调控,今后可将其独特的表达特性应用于基因治疗CHTR导致的牙根部牙本质发育缺陷和牙根形态异常,期望为该病的临床治疗提供新的思路。
　　 本研究应用组织工程胚层重组技术,将不同因子组合诱导的大鼠牙源性上皮细胞+间充质细胞-nHAC/PLA复合物移植裸鼠体内,其中TGF-β1+BMP4诱导组形成了牙体组织-骨复合体样结构,为体内牙齿再生发育建立了良好的实验模型,具有重要的理论价值。
　　 在分子和细胞水平证实了ADAM28基因可有效调控人牙周膜干细胞、人牙髓干细胞的增殖、分化和凋亡,为深入研究ADAM28在牙胚发育中的功能、机制奠定了基础。