人支气管上皮细胞和嗜中性粒细胞接触共培养诱导炎性细胞因子合成及葛根素的抑制作用

摘要

目的：⑴构建支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)和嗜中性粒细胞(Neutrophils细胞)接触共培养体系。⑵给予共培养体系不同剂量葛根素进行干预,探讨其对炎性细胞因子的影响。⑶探讨不同剂量葛根素对共培养体系NF-κB、p38MAPK信号转导通路的影响。
　　 方法：①采用免疫磁珠法分离纯化人外周血Neutrophils细胞,与BEAS-2B细胞接触培养构建共培养体系。②随机分为6个实验组:BEAS-2B单独培养组(BEAS-2B组),Neutrophils细胞(Neutrophils组),BEAS-2B细胞和Neutrophils细胞接触共培养～(BEAS-2B+Neutrophils组),50μg/ml葛根素干预BEAS-2B细胞和Neutrophils细胞共培养组(BEAS-2B+Neutrophils+PUE50组),100μg/ml葛根素干预BEAS-2B细胞和Neutrophils细胞共培养组(BEAS-2B+Neutrophils+PUE100组),200μg/ml葛根素干预BEAS-2B细胞和共培养组(BEAS-2B+Neutrophils+PUE200组)。③应用蛋白芯片筛查BEAS-2B细胞和Neutrophils细胞单独培养、联合培养、加葛根素干预培养体系12h后细胞因子表达差异；应用ELISA方法定量测定上述不同培养体系于培养第2h、6h、12h、18h炎性细胞因子浓度；应用Real-time PCR方法检测上述不同培养体系培养12h后BEAS-2B细胞和Neutrophils细胞中炎性细胞因子基因表达；应用Western blot方法对上述不同培养体系培养单独或接触共培养30min后BEAS-2B细胞和Neutrophils细胞中的Phospho-IκBα、IκB-α、Phospho—p38、p38蛋白的表达情况进行分析。
　　 结果：⑴BEAS-2B组及Neutrophils组在单独培养条件下,有少量的IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2分泌；BEAS-2B细胞和Neutrophils细胞联合培养上清液中IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2浓度升高。BEAS-2B+Neutrophils组与BEAS-2B组和Neutrophils组之和相比较,IL-6、IL-8、MCP-1、MIP—1α、MIP-1β、TIMP-2浓度明显增加(p<0.05)。给予不同浓度葛根素对联合培养的BEAS-2B细胞和Neutrophils细胞进行干预后,BEAS-2B+Neutrophils+PUE50组、BEAS-2B+Neutrophils+PUE100组、BEAS-2B+Neutrophils+PUE200组分泌的IL-6、IL-8、MCP-1、MIP—1α、MIP-1β、TIMP-2浓度有不同程度下降(与BEAS-2B+Neutrophils组比较,p<均<0.01)。⑵联合培养后BEAS-2B细胞中IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2基因表达水平明显上调,而经葛根素干预可显著抑制两种细胞联合培养上述炎性细胞因子基因表达。⑶于Neutrophils共培养的BEAS-2B细胞较单独培养的BEAS-2B细胞,其Phospho-IκB和Phospho-p38蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(p<0.001)。对共培养体系应用不同浓度的葛根素进行干预,BEAS-2B细胞与共培养体系中未经葛根素干预的BEAS-2B细胞相比,Phospho-IκB和Phospho-p38蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(p<0.01)。应用葛根素干预的共培养体系中的Neutrophils细胞较未经葛根素干预的Neutrophils细胞Phospho-IκB和Phospho-p38蛋白表达明显降低(p<0.01)。
　　 结论：①Neutrophils细胞与BEAS-2B细胞联合培养可上调BEAS-2B细胞中IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2基因表达和显著增加细胞培养上清液中上述炎性细胞因子浓度；②葛根素可有效抑制BEAS-2B细胞和Neutrophils细胞共培养体系IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2分泌并下调BEAS-2B细胞中上述蛋白质基因表达。③葛根素的抑制作用可能是通过抑制NF-κB、p38 MAPK信号转导通路实现的。