严重烫伤大鼠骨骼肌消耗的内质网应激机制及胰岛素治疗的作用

摘要

目的：高分解代谢是严重烧伤后代谢的显著特点，表现为明显的骨骼肌消耗，严重影响患者预后。我们前期研究发现泛素-蛋白酶体介导的蛋白降解及骨骼肌细胞凋亡是烧伤后骨骼肌消耗的主要机制，胰岛素治疗能够抑制上述过程。内质网(endoplasmicreticulum，ER)是蛋白质合成和修饰的重要场所，也是负责钙离子储存的细胞器，其稳态对细胞的功能和生存至关重要。如果内质网稳态失衡，将导致内质网应激反应（endoplasmicreticulumstress，ERS），后者广泛参与机体的代谢、炎症、肿瘤发生等过程，其介导的凋亡通路也是真核细胞重要的凋亡途径之一。为进一步阐明严重烧伤后骨骼肌消耗的机制，指导临床治疗，本课题拟通过三部分研究：（1）观察严重烫伤大鼠骨骼肌ERS活化、胰岛素信号通路、细胞凋亡及骨骼肌消耗改变；（2）ERS的治疗性药物4-苯基丁酸（4-phenylbutyricacid，4-PBA）干预严重烫伤大鼠骨骼肌ERS活化，观察胰岛素信号通路、细胞凋亡及骨骼肌消耗改变；（3）观察胰岛素治疗对严重烫伤大鼠骨骼肌ERS活化、胰岛素信号通路、细胞凋亡及骨骼肌消耗的影响，以探讨严重烫伤后ERS在骨骼肌消耗中的作用，明确胰岛素治疗对严重烫伤后ERS和骨骼肌消耗的影响，进一步丰富严重烧伤后骨骼肌消耗及胰岛素治疗作用的分子机制。
　　方法：（1）雄性Wistar大鼠64只，随机分为对照组（n=32）和烫伤组（n=32）。烫伤组大鼠背部制备30％体表面积（totalbodysurfaceaera，TBSA）Ⅲ°烫伤；对照组制备假伤模型。实验过程中监测体重变化，分别于伤后1d、4d、7d、14d（n=8）麻醉处死大鼠，分离获取胫骨前肌和比目鱼肌，称量肌肉重量。透射电镜观察胫骨前肌超微结构变化，免疫组织化学法检测胫骨前肌和比目鱼肌半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3表达，原位末端转移酶标记（TUNEL）法测定骨骼肌细胞凋亡，Westernblotting检测胫骨前肌和比目鱼肌ERS不同通路中葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulatedprotein78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologousprotein,CHOP)、Caspase-12及胫骨前肌中胰岛素信号通路中磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3kinase，PI3K）蛋白表达变化情况。
　　（2）雄性Wistar大鼠16只，随机分为烫伤组（n=8）和治疗组（n=8）。所有大鼠背部制备30%TBSAⅢ°烫伤。治疗组大鼠从伤后1d起给予4-PBA[溶于0.6%羧甲基纤维素钠（Carboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）中]治疗（700mg/kg·d，灌胃），烫伤组大鼠给予等量CMC-Na治疗。伤后14d麻醉处死大鼠，分离获取胫骨前肌和比目鱼肌，称量体重及肌肉重量。其余指标观察同前。
　　（3）雄性Wistar大鼠48只，随机分为烫伤组（n=24）和治疗组（n=24）。所有大鼠背部制备30%TBSAⅢ°烫伤。治疗组大鼠从伤后1d起给予甘精胰岛素注射液（溶于生理盐水中）治疗（1IU/kg·d，皮下注射），至伤后7d。烫伤组大鼠给予等量生理盐水治疗，至伤后7d。实验过程中监测体重及血糖变化，分别于伤后4d、7d、14d（n=8）麻醉处死大鼠，分离获取胫骨前肌和比目鱼肌，称量肌肉重量。其余指标观察同前。
　　结果：（1）在相同时间点和对照组相比，严重烫伤大鼠伤后4d、7d、14d体重明显减轻（P<0.01）；胫骨前肌重量及其与体重比值在伤后各时间点均明显下降（P<0.01）；比目鱼肌重量在伤后7d、14d有明显下降（P<0.01）。透射电镜观察发现烫伤后大鼠胫骨前肌部分细胞核有明显的凋亡改变，内质网明显扩张。伤后各时间点烫伤大鼠胫骨前肌及比目鱼肌细胞凋亡增加（P<0.05），同时伴有胫骨前肌及比目鱼肌Caspase-3表达增多（P<0.01）。烫伤后大鼠胫骨前肌GRP78蛋白表达伤后4d明显升高（P<0.01），伤后4d、7d比目鱼肌GRP78蛋白表达升高（P<0.05）。伤后4d、14d烫伤大鼠胫骨前肌Caspase-12活性体表达升高（P<0.05），比目鱼肌在伤后1d、4dCaspase-12活性体表达升高（P<0.05）。胫骨前肌CHOP表达在伤后各时间点均增加（P<0.01），比目鱼肌在伤后1d、4d、7dCHOP表达增高（P<0.05）。伤后7d、14d大鼠胫骨前肌磷酸化PI3K表达明显降低（P<0.05）。
　　（2）4-PBA治疗大鼠伤后7d体重较烫伤组增加（P<0.01），体重减轻趋势有所缓解。伤后14d4-PBA治疗大鼠胫骨前肌重量明显增加（P<0.05），但其与体重比值无明显改变（P>0.05）。治疗组比目鱼肌重量及其与体重的比值无明显变化（P>0.05）。透射电镜观察发现4-PBA治疗后骨骼肌细胞凋亡改变减轻，内质网扩张得到抑制。同时，治疗组大鼠胫骨前肌及比目鱼肌细胞凋亡减少（P<0.01），Caspase-3表达也明显减少（P<0.01）。伤后14d，4-PBA治疗组大鼠胫骨前肌及比目鱼肌GRP78、Caspase-12活性体、CHOP蛋白表达均较烫伤组明显减少（P<0.05），胫骨前肌磷酸化PI3K表达明显增加（P<0.01）。
　　（3）伤后14d胰岛素治疗组大鼠体重较同时间点烫伤组增加（P<0.05），同时胫骨前肌重量也有明显增加（P<0.01）。胰岛素治疗期间，治疗组血糖明显低于同时间点烫伤组（P<0.01）。同时，胰岛素治疗可减轻骨骼肌细胞凋亡改变，抑制内质网扩张。伤后4d、7d、14d胰岛素治疗大鼠胫骨前肌细胞凋亡减少（P<0.01）；伤后7d、14d比目鱼肌细胞凋亡减少（P<0.01），两者都伴有Caspase-3表达减少（P<0.05）。伤后4d、7d、14d，胰岛素治疗大鼠胫骨前肌及比目鱼肌GRP78表达增加（P<0.05）。伤后7d、14d治疗组大鼠胫骨前肌及比目鱼肌Caspase-12活性体表达较烫伤组明显减少（P<0.01）。伤后4d、7d、14d治疗组大鼠胫骨前肌CHOP表达均明显降低（P<0.01），伤后7d、14d治疗组大鼠比目鱼肌CHOP表达降低，差异有统计学意义（P<0.01）。伤后7d、14d胰岛素治疗大鼠胫骨前肌磷酸化PI3K表达明显增加（P<0.01）。
　　结论:（1）严重烫伤后大鼠骨骼肌ERS活化，可能是骨骼肌细胞凋亡、骨骼肌胰岛素信号通路异常和骨骼肌消耗的分子机制之一。
　　（2）胰岛素治疗能够缓解ERS，减少骨骼肌凋亡、胰岛素信号通路异常及骨骼肌消耗。胰岛素对ERS的干预作用可能是胰岛素治疗的作用机制之一。

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第一部分 严重烫伤大鼠骨骼肌中内质网应激反应的活化

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第二部分 4-苯基丁酸治疗对严重烫伤大鼠内质网应激反应及骨骼肌消耗的作用

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第三部分 胰岛素治疗对严重烫伤大鼠内质网应激反应和骨骼肌消耗的影响

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

综 述

参考文献

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