地黄低聚糖、Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞治疗心力衰竭效应和机制研究

摘要

背景:心力衰竭是严重危害人类健康的重要疾病之一。药物、介入及外科心脏移植是目前治疗心力衰竭主要方法,但不能从根本上改善患者的治疗状况,存在很大的局限性。干细胞移植能够再生功能心肌细胞,有望成为治疗心力衰竭的新手段。
　　目的:研究Nkx2.5基因、地黄低聚糖对骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的影响及机制。
　　方法:采用全骨髓差速贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,P3代骨髓间充质干细胞通过慢病毒转染Nkx2.5基因,培养至P5代以Brdu标记骨髓间充质干细胞用于干细胞移植。腹腔注射阿霉素制造心衰动物模型(累积剂量15mk/kg)。模型复制成功后随机分为5组:心衰对照组、骨髓间充质干细胞移植组、Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞移植组、地黄低聚糖组、联合治疗组。采用心脏超声检测大鼠的心功能;处死后称取心脏湿重,并计算心脏湿重/体重的比值;心脏标本冰冻切片进行免疫组织化学染色检查;HE常规染色观察心肌的病理改变, Masson染色计算胶原容积分数检测心肌纤维化程度;提取左心室心肌组织的总RNA,实时定量PCR检测大鼠心肌中心肌转录因子MEF2、GATA4,心肌结构蛋白cTnI、CX43,心肌纤维化相关基因TGF-β1、CollagenⅠ的基因表达水平;提取心室心肌组织的总蛋白,Western blot检测MEF2、GATA4、cTnI、CX43的蛋白表达水平。
　　结果:1.大鼠注射阿霉素后,表现为体重降低,心脏收缩、舒张、泵血功能下降,表明动物复制心衰模型成功。2.大鼠心脏标本Brdu免疫组织化学染色显示骨髓间充质干细胞组、基因转染组、联合组心肌组织中存在干细胞来源的Brdu阳性细胞,说明股静脉注射可以使干细胞归巢进入病变心脏。3.各干预组大鼠体重较心衰组增加,心脏湿重/体重较心衰组改善(P<0.05)。4.与心衰组相比,各干预组左室收缩末直径、容积减小(P<0.05),以联合组的改善最为明显;与心衰组相比,各治疗组FS、EF升高(P<0.05),基因转染组与骨髓间充质干细胞组相比有更大程度的改善(P<0.05),联合组与基因转染组相比FS、EF改善有增大趋势,但无统计学意义(P>0.05)。5.心肌组织HE染色提示:心衰组心肌纤维排列紊乱,部分心肌细胞水肿、脂肪变性,细胞间隙增大,存在局灶性坏死;各治疗组病理改变有所改善,且局部可见较多的毛细血管增生;联合组改善最明显,细胞肿胀减轻,局灶性坏死灶明显减少。6.与正常组相比,心衰组心肌组织胶原容积分数明显升高(P<0.05);与心衰组相比,各治疗组心肌组织胶原容积分数下降(P<0.05);基因转染组与骨髓间充质干细胞组心肌组织胶原容积分数无明显差异(P>0.05);联合组分别与基因转染组、地黄低聚糖组相比下降更为明显(P<0.05)。7.心衰组大鼠TGF-β1、CollagenⅠ的基因表达水平明显升高(P<0.05);与心衰组相比,各治疗组TGF-β1、CollagenⅠ的表达下降(P<0.05);联合组分别与基因转染组、地黄低聚糖组相比两基因表达水平明显降低(P<0.05)。8.各实验组心肌组织中特异性结构蛋白cTnI无明显改变。与正常组相比,心衰组CX43基因和蛋白表达水平明显下降(P<0.05);与心衰组相比,各治疗组CX43表达水平升高(P<0.05);基因转染组CX43的表达水平较骨髓间充质干细胞组升高更明显(P<0.05)。9.心衰组MEF2、GATA4表达水平较正常组明显下降(P<0.05);与心衰组相比,各治疗组MEF2、GATA4表达水平升高(P<0.05);基因转染组MEF2、GATA4表达水平较骨髓间充质干细胞组进一步升高(P<0.05)。
　　结论:
　　1.骨髓间充质干细胞、Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞、地黄低聚糖与联合治疗均可以有效改善心衰大鼠左室收缩泵血功能,抑制心肌纤维化,改善心室重构,以联合治疗的效果最显著。
　　2.骨髓间充质干细胞、Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞、地黄低聚糖与联合治疗均可改善心衰心肌的病理改变,减少细胞变性坏死,促进局部毛细血管增生,以联合治疗的改善最明显。各治疗组均可提高心衰心肌中CX43的表达水平,Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞与联合治疗提高CX43的效果更明显。
　　3.骨髓间充质干细胞、Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞、地黄低聚糖与联合治疗均可减少心肌组织中胶原蛋白含量,抑制胶原纤维形成,同时降低心衰心肌中TGF-β1、CollagenⅠ的表达水平,其中联合治疗的胶原形成抑制作用最强。
　　4.骨髓间充质干细胞、Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞、地黄低聚糖与联合治疗可增强GATA4、MEF2的表达,发挥改善心功能、抑制心室重构的功能。
　　5. Nkx2.5基因转染可增强骨髓间充质干细胞提高CX43、GATA4、MEF2等基因的表达,显著提高心脏的收缩泵血功能。
　　6.地黄低聚糖可与Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞产生协同效应,增强Nkx2.5基因转染骨髓间充质干细胞减轻心肌纤维化,抑制心室重构的效果。

目录

封面

声明

目录

缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞培养、基因转染和心衰模型的建立

1.实验材料

2.方法

3结果

4讨论

5结论

参考文献

第二部分：地黄低聚糖联合基因转染骨髓间充质干细胞治疗心力衰竭效应和机制

1.实验材料

2方法

3结果

4讨论

5结论

参考文献

干细胞移植治疗心力衰竭的研究进展

参考文献

攻读学位期间发表论文情况

致谢