IL-37在人体外周血CD4+CD25+调节性T细胞中的表达及其对免疫抑制功能的影响

摘要

目的:
　　1.证明白细胞介素-37(interleukin-37, IL-37)在人体外周血CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)中表达。
　　2.研究CD4+CD25+Treg活化程度与表达IL-37的时效关系。
　　3.证明IL-37的表达与CD4+CD25+Treg发挥免疫抑制效应有关。
　　方法:
　　第一部分:通过免疫磁珠分离技术,分离健康志愿者外周血中CD4+CD25+Treg细胞,应用流式细胞技术鉴定CD4+CD25+Treg细胞纯度。
　　1.增殖活性检测:设置刺激剂组(每1×105个CD4+CD25+Treg细胞加入20μl Dynabeads?Human Treg Expender)、非刺激剂组、空白对照组(无细胞组),通过CCK-8法检测各组CD4+CD25+Treg细胞增殖活性,得出时效关系(24h、48h、72h)。
　　2.IL-37表达情况检测:通过 Western blot技术检测刺激剂作用下,不同时段(24h、48h、72h)IL-37表达水平的变化。
　　3.IL-37表达位置检测:采用免疫荧光技术与激光共聚焦技术检测IL-37在Treg细胞内表达情况与表达位置。
　　第二部分:通过免疫磁珠分离技术,分离健康志愿者外周血中CD4+CD25+Treg细胞和 CD4+T细胞。通过 siRNA技术沉默 Treg细胞 IL-37表达,分别设置siRNA-scramble干扰后Treg细胞组、正常Treg细胞组、siRNA-IL37干扰后Treg细胞组。
　　1.SiRNA蛋白水平抑制效果检测:采用Western blot技术检测沉默效果。检测 siRNA-scramble干扰后Treg细胞组、正常Treg细胞组、siRNA-IL37干扰后Treg细胞组在刺激剂作用72h时,IL-37表达情况。
　　2.增殖活性检测:将CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T细胞共培养(按细胞计数1:1比例),另设空白对照组(CD4+CD25-T细胞)。分别设siRNA-scramble干扰后Treg细胞组、正常 Treg细胞组、siRNA-IL37干扰后 Treg细胞组。每1×105个CD4+CD25+Treg细胞加入20μl Dynabeads?Human Treg Expender,采用CCK-8法检测各组CD4+CD25+Treg对CD4+CD25-T细胞的抑制效应。
　　3.采用Elisa技术,检测不同时间CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T细胞组,空白对照组上清液中IL-2、IFN-γ/IL-4、IL-10、TGF-β水平的变化。
　　结果:
　　1.健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)经过MACS两次分选,应用流式细胞仪检测得到CD4+CD25+Treg纯度达93％,CD4+CD25+Treg使用台盼蓝染色检测,细胞活性大于97%。
　　2.应用Dynabeads?Human Treg Expender对CD4+CD25+Treg细胞刺激激活。采用CCK-8验证其增殖效果良好,并在刺激达到72h时最为明显。
　　3.通过Western blot检测,CD4+CD25+Treg细胞表达IL-37;在Dynabeads?Human Treg Expender作用(24h、48h、72h),CD4+CD25+Treg表达IL-37水平增高(P<0.05)。
　　4.免疫荧光与激光共聚焦显示,CD4+CD25+Treg表达IL-37,并且在胞质和细胞膜附近表达量较多。
　　5. CCK-8检测T淋巴细胞增殖活性实验中,SiRNA-IL-37干扰组与正常Treg共培养组、SiRNA-scramble干扰Treg组比较,OD450值存在明显升高(P<0.01),表明siRNA-IL-37干扰组Treg对CD4+CD25-T细胞抑制效应下降;siRNA-IL-37干扰 Treg组与 CD4+CD25- T细胞对照组相比较,OD450值无明显差异性(P>0.05),表明siRNA-IL-37干扰组对CD4+CD25-T细胞抑制效应微弱,与对照组无差异。
　　6.流式细胞检测SiRNA-IL-37干扰Treg组与正常Treg细胞组在刺激剂作用24h, Foxp3、CTLA-4表达情况,结果显示SiRNA-IL-37干扰Treg组较正常组Foxp3、CTLA-4分子表达下降均明显(P<0.05),说明CD4+CD25+Treg细胞内IL-37的表达能够明显影响CTLA-4和Foxp3的表达,且两者的表达变化趋势相同。
　　7.采用Elisa技术,检测正常CD4+CD25+Treg与siRNA-IL-37干扰CD4+CD25+Treg组细胞培养上清液中IL-10、TGF-β含量,结果表明siRNA干扰细胞两因子含量均有明显下降(P<0.01),表明CD4+CD25+Treg细胞IL-37的表达可能影响其抑制性细胞因子的生成。
　　8. siRNA-IL-37干扰Treg与CD4+CD25-T共培养组,72h检测上清中IL-2的浓度。检测结果显示,CD4+CD25-T细胞分泌IL-2,加入正常CD4+CD25+Treg细胞后IL-2浓度下降(P<0.01),但siRNA-IL-37干扰CD4+CD25+Treg细胞组IL-2分泌水平明显上升(P<0.01)。阴性对照scramble干扰Treg组与CD4+CD25+Treg细胞组分泌情况无差异(P>0.05)。实验中 IL-2由 T细胞分泌,干扰CD4+CD25+Treg细胞IL-37表达水平,共培养上清IL-2浓度较正常对照组显著增加,推断IL-37在胞内表达可能与Treg细胞抑制CD4+CD25-T细胞IL-2的分泌相关。
　　9. siRNA干扰 CD4+CD25+ TregIL-37表达后,其促进 Th2极化能力下降, IFN-γ/IL-4浓度比值上升,较正常对照组有统计学差异(P<0.01),效应 T细胞群向Th1趋势极化。实验结果显示,干扰CD4+CD25+Treg表达IL-37,IFN-γ/IL-4显著升高,因此,IL-37蛋白在胞内可能对 CD4+CD25+Treg介导的 Th2极化具有重要作用。
　　结论:
　　1.健康人体外周血 CD4+CD25+Treg能够表达 IL-37,在新鲜提取的健康人CD4+CD25+Treg细胞中IL-37存在并少量表达。
　　2.随着 CD4+CD25+Treg活化水平增高, IL-37表达水平逐渐升高,并在CD4+CD25+Treg细胞活性最强的72小时表达尤为明显。IL-37在胞质和细胞膜附近表达较丰富。
　　3.IL-37能够影响CD4+CD25+Treg对CD4+T细胞免疫抑制水平。干扰IL-37在CD4+CD25+Treg中的表达,Treg对CD4+T细胞的免疫抑制功能减弱。

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前言

第一部分 白细胞介素-37在人外周血CD4+CD25+调节性T细胞中表达

1.1 实验材料与方法

1.2 结 果

1.3 讨 论

1.4 小 结

第二部分 IL-37对人CD4+CD25+调节性T细胞免疫调节功能的影响

2.1 实验材料与方法

2.2 结 果

2.3 讨 论

2.4 小 结

全文小结

参考文献

文 献 综 述：

参考文献

攻读学位期间发表文章

致谢