Neuropilin-1在脓毒症小鼠CD4+CD25+调节性T细胞中的表达及其对免疫抑制功能的影响

摘要

研究目的:1.观察不同盲肠结扎比例对小鼠脾脏调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg，CD4+CD25+Treg)表面分子神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1)表达的影响。2观察不同浓度抗neuropilin-1干预对细菌脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)刺激的Treg表面分子neuropilin-1、膜相关转化性生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)、T淋巴细胞毒性相关抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)和特征性活性标志物——又头翼状转录因子-3(Forkhead box-p3transcription factor, Foxp3)表达的影响。3.观察不同浓度和不同时间抗neuropilin-1干预后的Treg对CD4+CD25-T淋巴细胞增殖功能、细胞凋亡及转录因子Smad2表达与磷酸化的影响。
　　 研究方法:1.将60只雄性BALB/c小鼠按照盲肠结扎长度在总盲肠中的比例分为轻度(结扎1/3)、中度(结扎1/2)和重度(结扎3/4)脓毒症组，分别制作盲肠结扎穿孔术(Cecal ligation and puncture，CLP)脓毒症模型;另外设置假伤组和对照组，每组各10只。分别于CLP24h后断颈处死，取脾脏分离CD4+CD25+Treg，通过FACS Calibur流式细胞分析仪检测细胞表面分子neuropilin-1和特征性活性标志物——Foxp3的表达。2.分选正常雄性BALB/c小鼠脾脏CD4+CD25+Treg后，分为正常细胞对照组、抗CD3/CD28组、不同浓度LPS(10、100、1000ng/ml)+抗CD3/CD28组;另外分离脾脏CD4+CD25+Treg后，分为对照组、抗CD3/CD28组、LPS(100ng/ml)+抗CD3/CD28组和LPS+抗CD3/CD28+不同浓度纯化的抗小鼠/大鼠neuropilin-1组(0.5、5、10μg/ml)，分别于培养24h后收集细胞通过FACSCalibur流式细胞分析仪检测细胞表面分子neuropilin-1、膜相关TGF-β、CTLA-4和Foxp-3表达。3.小鼠脾脏CD4+CD25+Treg分别用纯化的抗小鼠/大鼠neuropilin-1(0.5、5、10μg/ml)预先封闭1h后，在抗CD3/CD28和LPS诱导下，分别按照细胞数比例为1∶1与CD4+CD25-T淋巴细胞共培养;并设正常CD4+CD25+Treg和CD4+CD25T淋巴细胞对照组。分别培养12h、24h、48h后，通过Spectra MR全功能酶标仪检测CD4+CD25T淋巴细胞增殖功能、FACSCalibur流式细胞分析仪检测CD4+CD25T淋巴细胞凋亡和Western blot分析Smad2表达与磷酸化。
　　 研究结果:1与对照组和假伤组比较，CLP24h内随着盲肠结扎比例增加，生存率逐渐降低(P＜0.01); Foxp-3表达率随着盲肠结扎比例的增加逐渐升高，各组之间有显著统计学意义(P＜0.01);与轻度脓毒症组比较，中-重度脓毒症组脾脏CD4+CD25+Treg表面分子neuropilin-1表达率明显升高，具有显著统计学意义(P＜0.01)，中度脓毒症组脾脏CD4+CD25+Treg表面分子neuropilin-1表达率已经达到最高，与重度脓毒症组比较无统计学意义(P＞0.05）。2.与对照组或抗CD3/CD28组比较，小鼠脾脏CD4+CD25+Treg表面分子neuropilin-1、膜相关TGF-β、CTLA-4和Foxp-3表达随着LPS浓度的增加，逐渐增强，其中中浓度LPS刺激已经达到最大效能(P＜0.05或0.01);与LPS+抗CD3/CD28组比较，neuropilin-1和膜相关TGF-β表达随着抗体浓度的升高，其表达率逐渐下降，各组间有统计学意义(P＜0.05)，而抗neuropilin-1干预不能改变CD4+CD25+Treg表面分子CTLA-4和Foxp-3表达，无统计学意义(P＞0.05)。3.与对照组比较，抗CD3/CD28刺激12h后便能够促进小鼠脾脏CD4+CD25-T淋巴细胞增殖，差异有统计学意义（P＜0.05）;与LPS+抗CD3/CD28组比较，CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T淋巴细胞共培养12 h后，未经抗neuropilin-1封闭的CD4+CD25+Treg便开始抑制CD4+CD25-T细胞增殖，差异有统计学意义(P＜0.05)，但随着抗体浓度的增加，其抑制作用逐渐减弱，具有明显的浓度依赖性，其中5μg/ml组作用已经最为明显（P＜0.05）;与LPS+抗CD3/CD28组比较，CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T淋巴细胞共培养12 h后，未经抗neuropilin-1封闭的CD4+CD25+Treg便开始促进CD4+CD25-T细胞凋亡，但差异无统计学意义(P＞0.05)，而24h后，CD4+CD25-T细胞凋亡率进一步增加，差异有显著统计学意义（P＜0.01），同时CD4+CD25+Treg经5μg/ml抗neuropilin-1封闭后能够明显抑制其促进CD4+CD25-T淋巴细胞凋亡的作用，凋亡率明显降低，差异有显著统计学意义(P＜0.01);以β-actin作为内参，Westem blot定性分析体内实验各组脾脏 CD4+CD25T淋巴细胞内 Smad2和磷酸化-Smad2(Phospho-Smad2，P-Smad2)表达发现:对照组、假伤组和轻度脓毒症组Smad2和P-Smad2表达无明显区别，而中-重度脓毒症组Smad2和P-Smad2表达量明显增加;体外实验进一步表明未经5μg/ml抗neuropilin-1封闭的CD4+CD25+Treg与CD4+CD25T淋巴细胞共培养48h后能够明显增加Smad2和P-Smad2的表达，同时经5μg/ml抗neuropilin-1封闭后能够逆转这一作用。
　　 研究结论:1.盲肠不同结扎比例是脓毒症小鼠死亡的危险因素之一，Treg活性随着盲肠结扎比例的增加逐渐增强，其细胞表面分子neuropilin-1表达亦明显增强。2.LPS刺激能够促进Treg表面分子neuropilin-1、CTLA-4、膜相关TGF-β和特征性标志物Foxp3表达，随着抗neuropilin-1浓度的增加膜相关TGF-β表达逐渐减弱，而对CTLA-4、Foxp3表达无影响。3.Treg表面分子neuropilin-1通过影响膜相关TGF-β介导的免疫抑制机制参与Treg免疫负向调控作用。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、neuropilin-1在小鼠脓毒症模型脾脏Treg的表达

1．1 实验动物、仪器和试剂

1．1．1 实验动物

1．1．2 仪器及试剂

1．2 实验方法及观察指标

1．2．1 制作CLP小鼠脓毒症模型

1．2．2 实验分组

1．2．3 分离小鼠脾脏CD4+CD25+Treg

1．2．4 荧光抗体染色

1．2．5 FACS Calibur流式细胞分析仪

1．3 统计学方法

1．4 实验结果

1．4．1 盲肠不同结扎比例对CLP小鼠脓毒症模型24h内死亡率的影响

1．4．2 CD4+CD25+Treg活力及纯度检测

1．4．3 盲肠不同结扎比例对CLP24h后小鼠脓毒症模型CD4+CD25+Treg特征性标志物—Foxp-3表达的影响

1．4．4 盲肠不同结扎比例对CLP24h后小鼠脓毒症模型CD4+CD25+Treg表面分子neuropin-1表达的影响

1．5 讨论

1．6 小结

二：抗neuropilin-1对Treg膜相关TGF-β、CTLA-4和Foxp3表达的影响

2．1 实验动物、仪器和试剂

2．1．1 实验动物

2．1．2 仪器及试剂

2．2 实验方法及观察指标

2．2．1 分离纯化小鼠脾脏CD4+CD25+Treg

2．2．2 实验分组

2．2．3 荧光抗体染色

2．2．4 FACS Calibur流式细胞分析仪

2．3 统计学方法

2．4 结果

2．4．1 小鼠脾脏CD4+CD25+Treg活力及纯度检测

2．4．2 不同浓度LPS诱导24h后对小鼠脾脏CD4+CD25+Treg特征性标志物—Foxp-3表达的影响

2．4．3 不同浓度LPS诱导24h后对小鼠脾脏CD4+CD25+Treg表面neuropilin-1表达的影响

2．4．4 不同浓度LPS诱导24h后对小鼠脾脏OD4+CD25+Treg膜相关TGF-β表达的影响

2．4．5 不同浓度LPS诱导24h后对小鼠脾脏CD4+CD25+Treg表面分子CTLA-4表达的影响

2．4．6 不同浓度抗neuropilin-1干预24h后对小鼠脾脏CD4+CD25+Treg表面分子neuropilin-1和膜相关TGF-β表达的影响

2．4．7 不同浓度抗neuropilin-1干预24h后对小鼠脾脏CD4+CD25+Treg特征性标志物—Foxp-3和表面分子CTLA-4表达的影响

2．5 讨论

2．6 小结

三．抗neuropilin-1对CD4+CD25+Treg免疫抑制功能的影响

3．1 实验动物、仪器和试剂

3．1．1 实验动物

3．1．2 仪器及试剂

3．2 实验方法及观察指标

3．2．1 分离纯化小鼠脾脏CD4+CD25+Treg

3．2．2 CCK-8检测CD4+CD25-T淋巴细胞增殖功能细胞浓度滴定

3．2．3 实验分组

3．2．4 检测小鼠脾脏CD4+CD25-T淋巴细胞增殖功能

3．2．5 检测小鼠脾脏CD4+CD25-T淋巴细胞凋亡

3．2．6 Western blot检测OD4+CD25-T淋巴细胞内Smad2和磷酸化Smad2表达

3．2．7 FACS Calibur流式细胞分析仪

3．3 统计学方法

3．4 结果

3．4．1 小鼠脾脏CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T淋巴细胞活力及纯度检测

3．4．2 不同小鼠脾脏CD4+CD25-T淋巴细胞浓度对CCK-8检测CD4+CD25-T淋巴细胞增殖功能的影响

3．4．3 抗neuropilin-1对小鼠脾脏CD4+CD25+Treg抑制CD4+CD25-T淋巴细胞增殖功能的影响

3．4．4 5μ g／ml抗neuropilin-1封闭的CD4+CD25+Treg与CD4+CD25-T淋巴细胞共培养对CD4+CD25- T淋巴细胞凋亡的影响

3．4．5 小鼠脾脏Treg及抗neuropilin-1干预对CD4+CD25-T淋巴细胞内Smad2表达和磷酸化的影响

3．5 讨论

3．6 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 脓毒症免疫功能障碍机制及中药制剂调节效应研究进展

致谢