沉默信号调节因子在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达

摘要

慢性鼻窦炎伴鼻息肉( chronic rhinosinusitis with nasal polyps, CRSwNP)是耳鼻喉科的常见疾病,为鼻-鼻窦黏膜的慢性炎症性病变,在病理上主要表现为鼻窦和鼻腔粘膜炎性改变,并有水肿。鼻息肉发病率高,且容易复发,最新的欧洲鼻窦炎和鼻息肉诊疗意见书报道每年鼻息肉患病率可达10.9％,虽经鼻内镜手术与局部糖皮质激素治疗,仍有20%左右复发,是目前鼻科疾病治疗的一大难点。鼻息肉给患者生活、学习、工作造成诸多的障碍,给社会造成严重的影响和沉重的负担。鼻息肉治疗和预防成为亟待解决的一项重大的医学和社会问题。
　　慢性鼻窦炎伴鼻息肉的发病机制至今未完全阐明,目前认为其发病原因是局部微环境中的炎症性反应,多种细胞因子在局部病灶内长期存在并使组织发生一系列的病理变化。近年来研究发现一些内源性蛋白或外源性蛋白可通过病原相关分子模式受体结合被免疫细胞识别,刺激下游的信号通路,促进炎性因子分泌,从而发挥了炎症反应。目前,已知的DAMPs家族,如PLUNC和HMGB1。前期,我们研究发现HMGB1蛋白在鼻息肉组织中较正常鼻黏膜组织中表达增高,体外脂多糖可以诱导鼻黏膜上皮细胞细胞核内 HMGB1蛋白的主动转移和释放,这提示HMGB1可以从鼻黏膜上皮细胞内被释放出来,通过激活其他细胞参与免疫应答或炎症反应,从而参与鼻息肉的慢性炎症过程。但HMGB1蛋白从细胞核内向细胞质的移位和释放的调节机制尚未阐明。Scaffidi等人研究发现,乙酰化酶活性增强会导致细胞核内HMGB1高乙酰化,从而引起HMGB1释放至细胞质内,然后以分泌性溶酶体为载体,将HMGB1分泌到胞外,进而参与炎症的发生。根据以上的理论,我们将从具有去乙酰化作用的沉默信息调节因子入手,了解其在鼻黏膜组织中的表达和作用,初步探讨沉默信息调节因子参与调节HMGB1蛋白功能。沉默信息调节因子( silent information regulator2, Sir2)是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的第三类组蛋白去乙酰化酶。新近Nature等文献报道沉默信号调节因子中Sirtuins蛋白家族是参与调控衰老、氧化应激和炎症机制的上游信号通路,在呼吸道上皮细胞中病原感染和细胞衰老中起至关重要的作用。鼻息肉的发病机制中可能也存在经Sirtuins信号传导通路的干预和调控。本研究通过检测鼻息肉组织中沉默信号调节因子1和2(Sirt1,2)的阳性率和阳性细胞数,阐明从组织细胞水平上找到鼻息肉和正常鼻黏膜组织的区别;通过体外鼻黏膜上皮细胞培养,观察Sirt6在上皮细胞中的功能,从而深入探讨他们在鼻息肉发病中的作用,为进一步改善其预防和治疗水平提供理论依据。
　　第一部分 Sirt1和Sirt2在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达
　　目的:研究Sirt1和Sirt2在慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的表达水平,以探讨其在鼻息肉形成过程中发挥的作用。
　　方法:收集鼻息肉组织38例和正常鼻黏膜组织8例,分别进行 Western blot和组织切片免疫组化检测总Sirt1和Sirt2蛋白表达及其在细胞质、细胞核分布。
　　结果:1.免疫组化显示Sirt1主要分布在正常鼻黏膜中腺体细胞内,鼻息肉组织中主要分布在浸润的炎性细胞内,腺体细胞中未见或少见其表达;Sirt2主要分布在上皮细胞浆内,正常对照组明显高于鼻息肉组。2. Western blot显示正常对照组的Sirt1和Sirt2蛋白水平明显高于鼻息肉组(P值均小于0.01)。
　　结论:正常鼻黏膜中有一定量Sirt1和Sirt2表达,其表达降低可能参与了慢性鼻窦炎伴鼻息肉的形成和炎性反应过程。
　　第二部分 RNA干扰抑制Sirt6基因表达对鼻黏膜上皮细胞纤毛分化和HMGB1表达的影响
　　目的:观察siRNA Sirt6对鼻黏膜上皮细胞纤毛分化和HMGB1表达的影响。
　　方法:脂质体介导的siRNA Sirt6转染原代培养的鼻息肉上皮细胞后,Western blot检测鼻黏膜上皮细胞中 HMGB1和 Sirt6蛋白的表达;荧光显微镜下观察Sirt6下调后HMGB1蛋白在细胞中的分布以及纤毛的改变。
　　结果:与未转染组比较,siRNA Sirt6转染原代培养的鼻息肉上皮细胞1d,2d和3d后,Western blot法检测鼻黏膜上皮细胞中Sirt6有高的下调效应,细胞免疫荧光法显示HMGB1蛋白从胞核向胞浆移位,并且上皮细胞形态改变,纤毛数量随时间延长明显减少。
　　结论:质体介导的siRNA Sirt6转染原代培养的鼻黏膜上皮细胞,能够下调细胞中Sirt6表达,诱导HMGB1的移位和释放,纤毛数量减少,提示Sirt6蛋白在鼻黏膜上皮细胞的分化和炎性反应中可能发挥了重要作用。

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英文缩略词表

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前言

第一部分 Sirt1和Sirt2在鼻息肉中的表达

一．材料

二．实验方法

三．统计分析

四．结 果

五．讨 论

第二部分 RNA干扰抑制Sirt6基因表达对鼻黏膜上皮细胞纤毛分化和HMGB1表达的影响

一．材料

二．实验方法

三．统计分析

四．结 果

五．讨 论

综述

参考文献

硕士在读期间发表及已完成的论文

致谢