与创面愈合启动阶段相关的人皮肤αβT细胞和γδT细胞免疫激活机制的体外研究

摘要

目的:皮肤T细胞的激活在创面愈合的启动阶段有重要的作用,人皮肤T细胞无法免疫激活可能是慢性创面形成的主要原因之一。研究发现小鼠皮肤T细胞表面表达的连接粘附分子样蛋白(JAML)是创面愈合启动阶段中促进皮肤T细胞激活的重要共刺激分子。人体内也有JAML的表达,但其是否具有类似作用尚未得到验证。因此,我们提取了人皮肤αβT细胞和γδT细胞,用与JAML相关的多种激活剂和阻滞剂对其进行干扰,并测定其对干扰的不同反应,观察JAML是否具有作为人创面愈合启动阶段促进皮肤T细胞免疫激活的重要共刺激分子的能力,旨在进一步探索创面愈合过程中人皮肤T细胞的激活活化的细节,深化对创面愈合过程中免疫学机制的认识。
　　材料与方法:1.从组织中提取人皮肤T细胞,观察提取细胞的活性,检测皮肤T细胞的数量和表型。2.用100ng/ml的PMA和1000ng/ml的ionomycin满负荷刺激外周血T细胞及人皮肤T细胞,检测不同T细胞合成IL-2和IGF-1的水平。3.分别对外周血T细胞及人皮肤T细胞进行培养扩增,观察不同T细胞的扩增能力。4.采用不同剂量的 anti-CD3 mAb(0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)刺激人皮肤T细胞,检测其表面激活标志CD25、CD69的表达以及细胞分泌IL-2和IGF-1的水平。5.用4μg/ml重组柯萨奇-腺病毒受体蛋白(CAR)联合0.5μg/ml anti-CD3mAb或单独4μg/ml CAR刺激人皮肤T细胞,检测其表面激活标志CD25、CD69的表达以及细胞分泌IL-2和IGF-1的水平。6.将人皮肤αβT和γδT细胞分离,检测其表面JMAL和CD28的表达。7.从人皮肤T细胞中提取人皮肤γδT细胞,分别用4μg/ml CAR联合0.5μg/ml anti-CD3 mAb,单独4μg/ml CAR或单独0.5μg/ml anti-CD3 mAb刺激,检测其表面激活标志 CD25、CD69和表面共刺激分子CD80、CD86、JAML的表达,以及细胞分泌IL-2和IGF-1的水平。8.从人皮肤T细胞中提取人皮肤αβT细胞,用4μg/ml CAR联合0.5μg/ml anti-CD3 mAb刺激,检测其表面激活标志CD25、CD69和表面共刺激分子CD80、CD86、JAML的表达,以及细胞分泌IL-2和IGF-1的水平。再分别用4μg/ml CAR或0.5μg/ml anti-CD3mAb刺激,检测其表面共刺激分子CD28的表达。9.用激活的人皮肤γδT细胞和0.5μg/ml anti-CD3 mAb刺激人皮肤αβT细胞,检测人皮肤αβT细胞表面激活标志CD25、CD69的表达。
　　结果:1.从组织中提取的人皮肤T细胞活性良好,平均每克表皮组织能提出T细胞(2.63±1.72)×107个,αβT细胞:γδT细胞为7.3±1.08;每克真皮组织能提出T细胞(1.95±1.31)×107个,αβT细胞:γδT细胞为6.7±1.31。两者在细胞数量及细胞亚群之间的比例上差异不明显。皮肤中的γδT细胞均为Vδ1+细胞,未见Vδ2+细胞。2.在PMA和ionomycin的满负荷刺激下,外周血T细胞及人皮肤T细胞的IL-2和IGF-1合成水平明显升高,不同T细胞之间的合成水平无明显差异。3.外周血αβT细胞和γδT细胞,及人皮肤αβT细胞被成功扩增,人皮肤γδT细胞扩增失败,外周血和人皮肤αβT细胞的扩增倍数明显高于外周血γδT细胞。4.高于2μg/ml的anti-CD3mAb可激活人皮肤T细胞,细胞表面CD25和CD69表达上调,分泌IL-2和IGF-1增多。5.4μg/ml CAR联合0.5μg/ml anti-CD3mAb可激活人皮肤T细胞,细胞表面CD25和CD69表达上调,分泌IL-2和IGF-1增多。单独4μg/ml CAR刺激不能激活人皮肤T细胞。6.人皮肤αβT细胞表面无JAML的表达,CD28的表达率为45.59±5.73％;人皮肤γδT细胞无CD28的表达,JAML的表达率为8.56±2.19%。7.4μg/ml CAR联合0.5μg/ml anti-CD3mAb可激活人皮肤γδT细胞,细胞表面CD25、CD69、CD80、CD86、JAML表达上调,分泌IL-2和IGF-1增多。单独4μg/ml CAR或单独0.5μg/ml anti-CD3mAb刺激不能激活人皮肤γδT细胞。但单独0.5μg/ml anti-CD3mAb刺激能使人皮肤γδT细胞表面JAML表达上调。8.4μg/ml CAR联合0.5μg/ml anti-CD3mAb不能激活人皮肤αβT细胞,但能使细胞表面CD28表达上调。单独0.5μg/ml anti-CD3mAb刺激也能使人皮肤αβT细胞表面CD28表达上调,单独4μg/ml CAR刺激对人皮肤αβT细胞表面CD28表达无影响。9.激活的人皮肤γδT细胞联合0.5μg/ml anti-CD3 mAb可激活人皮肤αβT细胞,细胞表面CD25、CD69、表达上调。
　　结论:人皮肤T细胞分为αβT细胞和γδT细胞,JAML是协助全体人皮肤T细胞激活的重要共刺激分子,能为人皮肤γδT细胞的激活提供第二信号,协助其激活;而激活的人皮肤γδT细胞能为人皮肤αβT细胞提供激活所需的第二信号,协助其激活。提示创面中全部人皮肤T细胞的激活可能是通过先激活人皮肤γδT细胞,再由激活的人皮肤γδT细胞协助人皮肤αβT细胞的激活这个顺序进行的。

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中文摘要

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前言

第一部分 人皮肤αβT细胞和γδT细胞的提取及部分功能的比较

实验一 人皮肤αβT细胞和γδT细胞的分离及鉴定

材料

方法

结果

实验二 人皮肤αβT细胞和γδT细胞的功能分析

材料

方法

结果

讨论

第二部分 共刺激分子JAML在创面愈合启动阶段相关的人皮肤αβT细胞和γδT细胞免疫激活机制的体外研究

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述

附录：英文缩略词表

个人简历

攻读学位期间发表文章情况

致谢