激活WNT/β-Catenin信号通路促进梗阻性黄疸大鼠肝再生的作用机制研究

摘要

背景：
　　在肝胆胰外科领域，梗阻性黄疸(Obstructive jaundice，OJ)是患者就诊最常见的原因之一。伴有淤胆的肝脏疾病，如肝门部胆管癌、胆管囊状扩张症、胆石症等需要行肝脏部分切除术进行治疗。然而伴有黄疸的肝脏行大范围肝切除时术后并发症高，并存在肝功能衰竭的风险，这已成为肝胆外科亟待解决的重要基础性问题。既往研究表明这与残肝功能体积不足和再生能力下降有关。虽然目前对正常肝脏再生的机制有了一定了解，但是黄疸状态下影响肝再生的机制仍未阐明，特别是分子机制仍然模糊。临床上处理方法主要是术前的引流，术中的损伤控制手术以及术后的护肝治疗，虽然取得了一定疗效，但仍然是一种被动性的治疗，还存在一定的局限性，例如长时间的引流贻误了手术时机，内引流引起胆道感染和胰腺炎发作，一些胆管不扩张的淤胆和轻中度的黄疸水平如何制定肝切除手术规划等等。上述这些方法均未从根本机制上改善黄疸对肝再生的影响。因此研究黄疸状态下肝再生的分子机制，对于改变目前这种被动的“期待”治疗，完善伴有黄疸的肝切除术的治疗体系有重要的临床意义。
　　随着组学研究和生物信息学的发展，文献已报道通过基因芯片技术筛选得到与肝再生相关的若干信号通号，为了了解这些通路是否在OJ状态下也参与肝再生的过程，我们经过预实验筛选出在OJ大鼠肝切除术后肝再生过程中同样发挥重要作用的Wnt/β-Catenin信号通路进行研究。既往在正常大鼠70％肝切除模型中已经证明，Wnt/β-Catenin信号通路在肝再生过程中发挥着重要作用，但在OJ状态下，Wnt/β-Catenin信号通路在肝再生过程中如何发挥作用，肝再生受到抑制是否与Wnt/β-Catenin信号通路有关这些问题尚未明确，相关研究未见报道。因此本文在建立改良的大鼠OJ后肝切除+内引流的模型基础上，观察OJ对肝再生的影响和变化规律，研究Wnt/β-Catenin信号通路在黄疸条件下对肝再生的作用，探索黄疸对肝再生的影响的分子机制。
　　第一部分结合显微外科技术改良大鼠梗阻性黄疸后肝切除+内引流模型
　　目的:为了更好地研究黄疸的病理生理机制，既往已经建立了多种大鼠梗阻性黄疸后肝切除+内引流模型，但胆管堵塞、胆道感染等并发症仍常见，术后死亡率高，影响了模型的稳定性。本研究利用显微外科技术，建立改良的大鼠OJ后肝切除+内引流模型，评估改良模型的稳定性和安全性，为研究OJ对肝脏再生的影响提供稳定的模型保证。
　　方法:在建立大鼠OJ的基础上，改良了肝切除术后内引流的方法，将传统的扩张近端胆管与十二指肠内引流改良为近端扩张胆管与远端胰腺段胆管内支架引流的方法。所有的操作均在显微镜下完成。改良的具体方法如下:第一次手术结扎并切断胆总管，建立梗阻性黄疸模型。7天后进行第二次手术，用特制引流管将胰腺段胆总管与扩张近端胆总管连接建立胆管—胆管内引流，然后行70％肝切除。实验采用健康成年雄性SD大鼠，体重240-280g。根据手术方法不同将大鼠随机分为4组。Group1(G1):为假手术组，开腹后，游离胆总管但不做任何处理后关腹;Group2(G2):建立OJ7天后，行传统的近端扩张胆道—十二指肠内引流+70％肝切除;Group3(G3):非显微镜下建立OJ，7天后采用改良的扩张近端胆道—胆道内引流+70％肝切除模型，全程均不使用显微镜;Group(G4):全显微镜下建立OJ，7天后采用改良的胆道—胆道内引流+70％肝切除模型。观察术后手术并发症和死亡率，采用Kaplan-Meier法进行生存分析，在术后1h、6h、12h、1d、3d、7d、10d、14d时间乙醚麻醉下处死大鼠抽血并取材，比较各组生化指标、肝脏病理改变，评估新型模型的稳定性和安全性。
　　结果:三种OJ建模方法成功率分别为G286.3％，G388.8％，G497.5％(P＜0.05)，胆瘘和漏扎尾状叶胆管是造模失败的主要原因。OJ7天后行内引流+肝切除，G2、G3、G4三组早期肝脏功能快速恢复，7天后G4组肝功能最为稳定。术后两周并发症分别是G220％，G311.8％，G46.25％(P＜0.05)，三组的生存率分别为G260.0％，G368.8％，G492.0％(P＜0.05)。术后早期G3组与G4组淀粉酶一过性升高，G3组与G2组比较差异有显著性(P＜0.05)，G4组与G2组比较差异无显著性（P＞0.05）。
　　结论:结合显微外科技术，改良的大鼠OJ后肝切除+内引流模型手术创伤小，术后并发症低，术后生存率高，模型的稳定性和安全性优于传统方法，是胆道内引流相关实验研究的理想模型。
　　第二部分梗阻性黄疸对大鼠肝再生的影响及与Wnt/β-catenin信号通路的关系
　　目的:建立大鼠OJ后肝切除+内引流的肝脏再生模型，观察OJ后对肝再生的影响和变化规律，研究与肝脏再生相关的Wnt/β-Catenin信号通路在黄疸条件下对肝再生的作用，为探索黄疸对肝再生影响的分子机制提供依据。
　　方法:动物随机分为三组，分别为假手组、对照组（非梗黄70％肝切除）和实验组（梗黄后70％切除）。每组分六个观察时间点，分别为术后1h、6h、12h、24h、72h和168。观察比较三组之间血清生化指标变化、肝重体重比、肝脏再生率，免疫组织化学法计算肝脏Ki-67和PCNA标记指数。Western blot法检测肝组织中Wnt/β-Catenin通路相关蛋白表达;qRT-PCR法检测Wnt/β-Catenin通路相关基因在肝脏的表达。
　　结果:实验组和对照组术后均全部存活，实验组ALT和AST在术后1h、6h、12h和24h均高于对照组(P＜0.05);实验组Alb在术后24h、72h和168h均低于对照组(P＜0.05);实验组的肝体重比和肝再生率在72h和168h均低于对照组(P＜0.05);实验组的Ki-67标记指数和PCNA标记指数在12h、24h和72h均低于对照组(P＜0.05);western blot分析β-catenin在对照组6h表达量开始增加，在术后24h-72h达高峰，而在实验组β-catenin的表达在术后12h才开始增加，较对照组延迟，但无明显的表达高峰。对照组中cyclin D1和cyclin E1蛋白在术后12h开始高表达，持续至术后72h，而实验组中蛋白表达24h开始，表达高峰较对照组延迟;qRT-PCR分析对照组中cyclin D1和cyclin E1在术后6h表达量开始升高，在24h和72h达到高峰，而实验组mRNA表达在术后24h开始升高。实验组cyclin D1和cyclin E1的基因表达在12h、24h和72h均低于对照组(P＜0.05)。
　　结论:梗阻性黄疸行肝切除后肝脏再生受到明显抑制，表现为肝再生延迟，与Wnt/β-Catenin信号通路受抑制，β-Catenin表达受抑制有关。
　　第三部分Wnt激动剂对梗阻性黄疸大鼠肝切除术后肝脏的保护性作用及机制
　　目的:我们在第二部分研究中发现，OJ使大鼠肝切除后肝再生延迟，与Wnt/β-catenin信号通路受抑制，β-catenin低表达有关。因此在本部分研究我们在OJ大鼠肝切除术前通过外源性药物激活Wnt/β-catenin通路，观察肝切除术后肝再生变化，并探讨其分子机制。
　　方法:雄性SD大鼠被随机分为3组。Group1(G1):为假手术组，大鼠只进行开腹和关腹处理;Group2(G2):为对照组，OJ7天后行内引流+70％肝切除前，腹腔注射0.9％生理盐水;Group3(G3):为治疗组，大鼠在梗阻性黄疸7天后行内引流和70％肝切除，肝切除前腹腔注射 Wnt激动剂[(2-amino-4-[3,4-(methylenedioxy)benzylamino]-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine)],5mg/kg。大鼠在术后1h，6h，12h，24h，72h和168h6个时间点取材。观察比较三组之间术后肝损伤、肝脏再生变化，Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白表达变化。
　　结果:实验组术后的肝功能和肝脏的再生相关指数均好于对照组，实验组ALT和AST在术后6h、12h和24h均低于对照组(P＜0.05);实验组TBIL在术后12h和24h均低于对照组(P＜0.05);实验组Alb在术后72h和168h均高于对照组(P＜0.05);实验组的肝体重比和肝再生率在72h和168h均高于对照组(P＜0.05);实验组的Ki-67标记指数和PCNA标记指数在24h和72h均高于对照组(P＜0.05);western blot分析β-catenin在实验组6h开始表达量开始增加，在术后24-72h达高峰，而在对照组β-catenin的表达在术后12h才开始增加，较实验组延迟，但无明显的表达高峰。实验组中cyclin D1和cyclin E1蛋白在术后12h开始高表达，持续至术后72h，而对照组中蛋白表达24h开始，表达高峰较对照组延迟;qRT-PCR分析实验组中cyclinD1和cyclinE1在术后6h表达量开始升高，在24h和72h达到高峰，而对照组cyclin D1和cyclin E1在术后24h表达量开始升高，实验组基因表达在12h、24h和72h均高于对照组(P＜0.05)。
　　结论:梗阻性黄疸大鼠肝切除术后肝再生延迟启动与wnt/β-catenin信号通路受抑制有关，通过激活wnt/β-catenin信号通路能够改善肝功能，促进肝脏再生，是预防和治疗梗阻性黄疸肝切除后肝功能不全的新途径。

目录

声明

摘要

英文略缩词表

第一部分 结合显微外科技术改良大鼠梗阻性黄疸后肝切除+内引流模型

前言

1．材料和方法

2 结果

3．讨论

4．小结

第二部分 梗阻性黄疸对大鼠肝切除术后肝再生的影响及与wnt／β-catenin信号通路的关系

前言

1．材料和方法

2．实验结果

3．讨论

4．结论

第三部分 Wnt激动剂对梗阻性黄疸大鼠肝切除术后肝脏的保护性作用及机制

前言

1．材料和方法

2．实验结果

3．讨论

4．结论

参考文献

综述 Wnt／β-catenin信号通路在肝胆外科的研究进展

攻读学位期间发表论文

致谢