DDX51基因通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进乳腺癌细胞增殖的机制研究

摘要

乳腺癌是对现代女性健康威胁最严重的一种恶性肿瘤，数据统计显示2014年全球范围内女性乳腺癌新发病例占全部恶性肿瘤中的29％，死亡病例占比高达15％。尽管随着治疗手段的多样化和规范化，乳腺癌早期患者的5年生存率得到了显著提升，但是对于中晚期患者来说，癌细胞转移已经成为其死亡的首要原因。医学界最近几年针对乳腺癌的发病机理进行了系统深入的研究，在某些研究已经深入到靶向治疗药物的研发，并逐渐进行临床试验，但是最终效果不是十分理想，在接受治疗后仍有很大一批患者出现了转移和复发。所以需要对乳腺癌的发病机理及分子机制进行更加深入广泛的研究，进而为临床医学治疗提供依据和参考。
　　乳腺癌作为一种典型的恶性肿瘤，其转移过程同样是一个极其复杂的，涉及到多个基因、多个步骤以及多因子的互相影响和互相作用，这个过程也是现阶段医学界恶性肿瘤转移治疗工作的重中之重，医学界目前的共识是只有对肿瘤的转移起到有效的控制和阻断，才能够真正将肿瘤尤其是恶性肿瘤彻底治愈。对于大多数肿瘤来说，其转移和侵袭的能力都是随着病情的发展，肿瘤细胞不断变异而获得的。因此现阶段肿瘤转移研究的热点就是从分子水平上对肿瘤转移的相关基因及转移机制进行研究。
　　DEAD-box(DDX)蛋白属于保守程度极高的一类RNA解旋酶，其广泛存在于原核生物和真核生物中，并在其中发挥着重要的作用。而近些年来，DDX基因被更多的报道参与多种肿瘤的发生中。例如，DDX2A表达的上调与非小细胞肺癌(NSCLC)的转移相关。DDX5能够促使乳腺癌和肺癌细胞的增殖。DDX46能够促进食管鳞状细胞癌细胞的增殖并抑制癌细胞的凋亡。而DDX51作为全家族的一个新基因，是由666个氨基酸组成的。除了其在非小细胞肺癌中的促增殖作用，DDX51的甲基化状态也能够用来区分B与T急性淋巴细胞白血病患者。它在28S rRNA基因的3'端的成熟中也发挥重要作用。但DDX51与乳腺癌的相互关系，目前还是研究的空白。
　　在本研究中，我们利用分子生物学技术测定DDX51对MCF-7细胞的影响，探讨DDX51在乳腺癌中的作用。我们的数据表明DDX51在乳腺癌中的表达升高，并于临床分期与预后相关。沉默DDX51后显著抑制MCF-7细胞系的增殖和DNA合成，但不影响其侵袭和迁移能力。DDX51可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进MCF-7细胞增殖。本研究将为乳腺癌患者的治疗提供新的线索，推动乳腺癌的治疗进程。
　　第一部分 DDX51在乳腺癌组织中的表达及临床意义
　　目的:
　　观察DDX51在乳腺癌组织中的表达情况，探究其与乳腺癌临床分期及预后关系。
　　方法:
　　1.采用RT-PCR方法检测57例乳腺癌组织及正常乳腺腺体组织之中DDX51基因mRNA的表达情况，并进行形态学观察。
　　2.采用RT-PCR分析57例乳腺癌组织中DDX51的mRNA表达，并分析乳腺癌中DDX51基因mRNA的表达与临床病理因素的关系。
　　3.定期随访纳入分析57例乳腺癌患者，采用Kaplan-Meier法计算患者的5年累积存活率，分析DDX51表达与乳腺癌患者预后的关系。
　　4.充分借助SPSS19.0软件来对数据进行统计、分析，借助四格表资料的x2检验来进行计数资料的对比;计量资料采用t检验或方差分析;采用Kaplan-Meier法计算患者的5年累积存活率，以P＜0.05为显著性差异。
　　结果:
　　1.DDX51在乳腺癌组织中及正常乳腺腺体组织中mRNA的含量分别为0.493±0.084、0.156±0.076，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　2.DDX51在临床分期Ⅲ-Ⅳ期组较Ⅰ-Ⅱ期组表达升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);DDX51表达量而与年龄、有无淋巴结转移无明显差异(p＞0.05）。
　　3.患者的5年累积存活率结果显示DDX51表达水平与乳腺癌患者无病生存期相关，DDX51高表达组乳腺癌患者5年生存率低于低表达组患者，两组间生存率的差别具有统计学意义(P＜0.05）。
　　结论:
　　1.DDX51的mRNA在人乳腺癌癌组织中的表达明显高于其在对应正常乳腺腺体组织中的表达，DDX51在临床分期Ⅲ-Ⅳ期组较Ⅰ-Ⅱ期组表达升高。
　　2.DDX51高表达组乳腺癌患者5年生存率低于低表达组患者，提示预后不良。
　　第二部分 DDX51对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭能力的影响目的:
　　观察DDX51在乳腺癌MCF-7细胞中的表达情况，探究其对MCF-7细胞增殖、侵袭能力的影响。
　　方法:
　　1.通过siRNA干扰MCF-7细胞中DDX51的mRNA表达，采取RT-PCR和Western-blot法检测DDX51的mRNA和蛋白表达水平。
　　2.采用MTT法及BrdU法分别检测沉默DDX51mRNA表达后的MCF-7细胞的生长和增殖情况。
　　3.应用细胞划痕实验和transwell细胞迁移实验观察细胞迁移及侵袭能力的改变。
　　结果:
　　1.慢病毒对MCF-7细胞的感染率在90％以上。各组lenti-shDDX51的mRNA水平均降低，而lenti-shDDX51-1沉默效果最好，达到了80％以上。此外，我们在蛋白水平的进一步证实DDX51基因沉默的效率。
　　2.在感染120h后lenti-shDDX51-1组细胞数目约减少到对照组的45.4％。进一步发现，lenti-shDDX51-1组DNA含量只有对照组(lenti-NC)的47.5％。
　　3.沉默DDX51对MCF-7乳腺癌细胞侵袭能力的影响小(P＞0.05）。细胞划痕试验发现两组的划痕愈合率基本相同(P＞0.05）。
　　结论:
　　1.siRNA可有效抑制MCF-7细胞的DDX51表达。
　　2.沉默DDX51后显著抑制MCF-7细胞系的增殖和DNA合成。
　　3.沉默DDX51不影响MCF-7细胞侵袭能力。
　　第三部分DDX51对乳腺癌Wnt/β-catenin信号通路的调控研究
　　目的:
　　观察DDX51在乳腺癌Wnt/β-catenin信号通路的调控作用及分子机制，为乳腺癌的治疗提供新的靶点。
　　方法:
　　1.Western blot实验检测抑制MCF-7细胞DDX51表达和LGK974处理对Wnt/β-catenin信号通路关键分子的调节作用。
　　2.MTT实验检测各组MCF-7细胞的增殖能力。
　　结果:
　　1.Lenti-shDDX51-1(-)组MCF-7细胞β-catenin，cyclin D1，TCF禾口myc蛋白的表达量较Lenti-NC(-)组显著降低(P＜0.001)，而DKK1的表达量增加。与此同时LGK974组MCF-7细胞β-catenin，cyclin D1，TCF和myc蛋白的表达量较Lenti-NC(-)组也显著降低(P＜0.001)，而DKK1的表达量增加。
　　2.LGK974组、Lenti-shDDX51-1(-)组、Lenti-shDDX51-1(+)组MCF-7细胞增殖较Lenti-NC(-)组显著减慢P＜0.05）。而LGK974组、Lenti-shDDX51-1（-）组、Lenti-shDDX51-1(+)组MCF-7细胞增殖无差异(P＞0.05）。
　　结论:
　　1.DDX51对Wnt/β-catenin信号通路可能具有正向调节的功效。
　　2.DDX51可能通过Wnt/β-catenin信号通路实现了对MCF-7细胞增殖能力的促进作用。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照

引言

参考文献

第一部分 DDX51在乳腺癌组织中的表达及临床意义

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

6 小结

参考文献

第二部分 DDXS1对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭能力的影响

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

6 小结

参考文献

第三部分 DDX51对乳腺癌Wnt／β-catenin信号通路的调控研究

1 前言

2 实验材料

3 方法

4 结果

5 讨论

6 小结

参考文献

全文总结

综述 DDX(DEAD-box)蛋白家族RNA解旋酶与乳腺肿瘤关系现状的研究

个人简历、在校期间发表的学术论文

致谢