经腰椎穿刺注射干细胞内耳移植新途径的探索研究

摘要

本文主要从以下几个部分进行论述：
　　第一部分 人脐带间充质干细胞和诱导多能干细胞的培养与鉴定
　　目的：培养人脐带间充质干细胞及人诱导多能干细胞，对细胞进行鉴定。对两种细胞进行比较，探讨适用于大量培养以满足体内移植治疗的细胞类型。
　　方法：使用组织块贴壁法从脐带组织中分离人脐带间充质干细胞。培养、鉴定人脐带间充质干细胞及人诱导多能干细胞，绘制两种细胞的生长曲线，并比较细胞形态。
　　结果：组织块贴壁法成功分离间充质干细胞，经鉴定其表型CD73(+)，CD105(+)，CD31（-），CD34（-），符合脐带间充质干细胞特点。诱导多能干细胞NANOG(+)、OCT-4(+)、SOX-2(+)、SSEA-4(+)、TRA-60(+)和TRA-81(+)，符合诱导多能干细胞特点。脐带间充质干细胞呈梭形，以漩涡样排列，其倍增时间约42小时。诱导多能干细胞呈圆形或椭圆形，呈集落生长，其倍增时间约18小时。
　　结论：人脐带间充质干细胞及诱导多能干细胞增殖速度快，状态稳定，适合用于以移植治疗为目的的大量繁殖。
　　第二部分 经腰椎穿刺干细胞内耳移植注射新途径的探索研究
　　目的：摸索建立一种在人类感音神经性耳聋大型哺乳动物模型上可行的内耳干细胞移植方法，检测经腰椎穿刺蛛网膜下腔注射移植的人诱导多能干细胞在Mitf基因突变耳聋猪的内耳及全身的分布情况，检测对听性脑干反应阈值的影响。
　　方法：培养及鉴定人诱导多能干细胞。选择Mitf基因突变的荣昌猪作为神经性耳聋模型的实验对象，移植干细胞的荣昌猪为实验组，单纯注射生理盐水的荣昌猪为对照。将人诱导多能干细胞经蛛网膜下腔注射的途径移植到实验组荣昌猪体内。设置观察期为移植后1天、移植后3天和移植后7天，在移植前和处死前行全身麻醉后测定听性脑干反应阈值。按观察期的时间点处死动物取耳蜗及其他组织。制作冰冻组织切片，行免疫组织荧光染色，用人特异性抗体检测供体细胞。提取蛋白质，使用蛋白印迹法检测移植细胞蛋白的表达。提取RNA，使用RT-PCR法检测供体细胞基因在实验对象体内分布。
　　结果：经蛛网膜下腔穿刺注射的人诱导多能干细胞在移植后可以在实验对象内耳检出;同过蛋白质印迹法在移植后1天、3天和7天可以在内耳、腰椎段脊髓、胸椎段脊髓、颈椎段脊髓、延髓、小脑、大脑、心、肝、脾、肺、肾中检出移植细胞的蛋白表达。通过RT-PCR方法移植后1天、3天和7天可以在腰椎段脊髓、胸椎段脊髓、颈椎段脊髓、延髓、小脑、大脑、心、肝、脾、肺、肾中检出移植细胞的基因表达。在移植前后，Mitf基因突变荣昌猪的听性脑干反应的波形未能引出。
　　结论：数据表明，可以在内耳及其余脏器中检测出移植细胞的蛋白及基因的表达，移植后Mitf突变耳聋猪的听性脑干反应测听在120 dB SPL未能引出波形，移植后螺旋神经节细胞病变未见继续进展。经腰椎穿刺注射是内耳干细胞移植的新途径，但对耳聋治疗效果有待进一步探索。

目录

论文说明

声明

英文缩略词表

摘要

第一部分 人脐带间充质干细胞和诱导多能干细胞的培养与鉴定

前言

材料

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 经腰椎穿刺干细胞内耳移植注射新途径的探索研究

前言

材料

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述 干细胞治疗神经性耳聋的研究与进展

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