人胚胎干细胞诱导分化为视网膜感光前体细胞的实验研究

摘要

目的:
　　1.观察hESC向视网膜感光前体细胞分化过程中的形态学变化，通过比较不同的培养方法探讨最优的分化培养策略。
　　2.检测hESC向视网膜感光前体细胞分化过程中Ki67、SSEA4、Otx2、Sox2、Rhodopsion等基因在不同培养时期的表达规律。
　　方法:
　　1.采用贴壁培养加悬浮培养的方式诱导hESC H1细胞系向视网膜前体细胞分化，并通过免疫荧光染色的方法观察hESC定向诱导分化为视网膜感光前体细胞培养第0、第10、第20、第30天不同时间点细胞形态和增殖周期的特性;
　　2.通过Western Blot、qRT-PCR等方法检测hESC定向诱导分化为视网膜感光前体细胞培养第0、第10、第20、第30天不同时间点基因表达水平和相应蛋白的变化。
　　结果:
　　1.H1细胞在Matrigel胶上6小时左右即可贴壁，贴壁后细胞由圆形逐渐伸出伪足向四周延展，胞体呈长梭形，光镜下胞体透亮，折光性较强，核分裂像明显，细胞生长2～3天后相邻细胞集落逐渐融合，细胞呈网状聚集，细胞融合度在培养2-3天时可达80-90％左右。
　　2.H1细胞在拟胚体培养基中生长1天后散在的细胞即可聚集成球状细胞团，根据细胞数目不同细胞团的直径也不尽相同，随着培养时间的延长细胞团直径略有增长，在光镜下观察可见拟胚体细胞团中间稍暗周边透亮，细胞失去贴壁时的长梭行态并互相紧密贴合在拟胚体细胞团块内。
　　3.拟胚体在视网膜感光前体细胞分化培养基中第一天即可贴附于孔底，细胞团中间密度较大细胞紧密排列，周围密度较小可见细胞爬出，随着培养时间的延长，细胞团周围逐渐有类圆形细胞爬出，初始时细胞体积较小，排列拥挤，在向四周延展的同时，细胞逐渐变大，细胞形态由原来的类圆形变为长梭形，在第10天左右形成玫瑰花结形状，细胞形态随着时间的延长细胞轴突逐渐增多伸长，与神经细胞类似。
　　4.细胞免疫荧光、Western Blot、qRT-PCR等方法结果显示hESC定向诱导分化为视网膜感光前体细胞过程中，第0、10、20、30天时Otx2和Sox2二者始终阳性表达;SSEA4表达量随培养时间的延长减少;Ki67表达量逐渐减少;Rhodopsin始终不表达。
　　结论:
　　改良SFEB/DLFA分化方法，即在拟胚体培养和视网膜感光前体细胞分化培养基中分别添加B-27、Noggin、Dkk-1以及IGF-1等细胞因子可使胚胎干细胞在自身基因调控与分化培养基共同作用下，在无血清无feeder条件下高效向视网膜感光前体细胞分化。
　　视网膜感光前体细胞分化培养过程中细胞的分裂增殖能力逐渐降低，D30时仍然具有部分干细胞分化增殖能力，SSEA-4表达量减少，表示细胞逐渐分化成熟，Otx2基因与Sox2基因作为眼发育过程中重要的转录因子、视网膜祖细胞的重要标记物在视网膜感光前体细胞分化中高表达，但尚未发育为成熟的视网膜光感受器细胞。

目录

声明

论文说明

缩略词表

摘要

前言

第一部分 hESCs诱导分化为视网膜感光前体细胞

前言

材料和方法

1、主要实验器材与试剂

2．方法与步骤

结果

1．H1细胞形态学观察

2．拟胚体形态学观察

3．视网膜感光前体细胞形态学观察

4．细胞免疫荧光结果

讨论

第二部分 hESCs诱导分化为视网膜感光前体细胞过程中的基因表达

前言

材料和方法

1、主要实验器材与试剂

2．方法与步骤

结果

3．1 Western blot结果

3．2 RNA定量检测

讨论

全文结论

视网膜感光细胞变性疾病的干细胞治疗进展

在读期间发表论文情况

致谢