目的:骨肉瘤是儿童青少年中最常见的原发恶性骨肿瘤。其治疗常因为肿瘤出现耐药、转移和复发而失败。即使是较为激进的治疗方案也无法保证患者的长期生存，目前患者的5年总体生存率停滞在60-80％已有三十余年。越来越多的证据显示肿瘤干细胞可能是肿瘤耐药、复发和转移的重要原因之一，而Notch和Wnt/β-catenin信号通路对于维持肿瘤干细胞的自我更新、耐药和再生等干性又至关重要。最新研究表明，这两种信号通路在肿瘤干细胞中均处于激活状态，其部分原因正是由于某种miRNA的失调。MiR-135b被发现在包括骨肉瘤在内的多种恶性肿瘤中呈异常表达，且某些肾小球肾病研究发现，上调MiR-135b可激活Wnt/β-catenin信号通路。还有研究显示，在成骨细胞中，已激活的Wnt/β-catenin通路可以激活Notch通路。基于以上背景，本研究的目的是，探索miR-135b异常表达对骨肉瘤转移和复发的影响，以及其具体的调节机制，为未来可能的靶向治疗提供一定的理论基础。 方法:第一部分:①分别对骨肉瘤原发灶和肺转移灶标本，以及高转移性骨肉瘤细胞系（LM-5和M132）和低转移性骨肉瘤细胞系（Saos-2和HuO9）中的miR-135b表达进行了定量检测对比。观察不同组织标本及细胞系之间miR-135b表达水平的差异。②通过细胞迁移和侵袭实验，观察miR-135b表达对骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力的影响。并利用miR-135b过表达Saos-2细胞和正常Saos-2细胞建立动物模型，观察miR-135b表达对骨肉瘤肺转移及复发的影响。第二部分:①对骨肉瘤肿瘤干细胞和普通骨肉瘤细胞中的miR-135b表达进行检测、对比，观察两者之间的差异。同时对普通骨肉瘤细胞进行过表达miR-135b干预，观察其对肿瘤干细胞干性的影响。②分别对miR-135b过表达骨肉瘤细胞和移植瘤组织中，Notch信号通路下游蛋白HES1的表达和Wnt/β-catenin通路的活性进行对比观察。同时观察miR-135b沉默的骨肉瘤细胞中，HES1和β-catenin表达的变化。③构建Notch1和/或β-catenin沉默的Saos-2骨肉瘤细胞系，观察调控Notch和Wnt/β-catenin信号通路对骨肉瘤细胞中miR-135b的生物学功能影响。④使用靶向扫描V6.2计算算法(miRanda and miRDB)对miR-135b潜在的靶向基因进行筛查。对TET3、GSK3β、β-TrCP、CK1α和APC等可能的靶基因在miR-135b沉默和过表达的骨肉瘤细胞中的mRNA和蛋白表达水平进行检测，观察它们的表达水平与Wnt/β-catenin及Notch信号通路之间的关系。⑤分别将含野生型3'UTR和突变型3'UTR的质粒转染到不同miR-135b表达的Saos-2和HuO9细胞中，使用RNA免疫沉淀反应(RIP)和荧光素酶报告实验检测，探索miR-135b靶基因的结合与否。⑥将miR-135b的靶基因转染到miR-135b过表达的Saos-2和HuO9细胞中，通过测量Wnt/β-catenin通路活性和Notch信号通路相关蛋白的表达，观察TET3等靶基因是否直接与miR-135b诱导的Notch和Wnt/β-catenin信号通路激活相关。⑦在动物试验中，观察不同miR-135b表达对肿瘤干细胞诱导成瘤的影响，并按单独注射顺铂或联合使用顺铂和miR-135b抑制剂，将裸鼠分为对照组和试验组，观察两组之间疗效的差异。第三部分:①对112例骨肉瘤患者标本的miR-135b表达水平与生存之间的关系进行了评估。②对骨肉瘤标本中的miR-135b及其靶向基因之间的表达水平及相互间关系进行了分析。 结果:第一部分:①MiR-135b在骨肉瘤组织中呈高表达。骨肉瘤肿瘤组织和骨肉瘤细胞系中的miR-135b表达显著高于正常骨和正常成骨细胞。骨肉瘤肺转移灶标本中，miR-135b的表达比原发灶标本要显著提升;高转移性骨肉瘤细胞系（LM-5和M132）中，miR-135b的表达比低转移性骨肉瘤细胞系（Saos-2和HuO9）中显著提高。②MiR-135b过表达可刺激骨肉瘤转移和复发。过表达miR-135b可在体外实验中显著提升MG63和Saos-2细胞的迁移和侵袭能力。更为重要的是，在裸鼠动物实验中，过表达miR-135b可以诱导Saos-2细胞转移到肺，而对照组的Saos-2细胞并不诱导肺转移。miR-135b表达更高的肿瘤在顺铂治疗后，很快又开始生长，而miR-135b正常表达的肿瘤则在治疗后30天内未再出现生长。第二部分:①MiR-135b过表达可提高骨肉瘤肿瘤干细胞干性。在CD133和ALDH1阳性的Saos-2细胞和HuO9细胞中，miR-135b的表达要远高于CD133和ALDH1阴性的细胞。过表达miR-135b与正常miR-135b表达对照组相比，可以显著地增加CD133和ALDH1阳性的Saos-2细胞和HuO9细胞亚群数量。②过表达miR135b可通过激活Notch and Wnt/β-catenin通路提高骨肉瘤细胞的肿瘤干细胞特性。在miR-135b过表达的骨肉瘤细胞中，Notch信号通路下游蛋白HES1的表达和Wnt/β-catenin通路的活性均比对照组细胞显著上升。miR-135b过表达还可增加β-catenin在Saos-2和HuO9细胞核中的积累。在miR-135b过表达的Saos-2细胞形成的移植瘤组织中，HES1和β-catenin的表达同样高于对照组。在miR-135b沉默的MNHG/HOS细胞中，HES1和β-catenin表达与对照组相比受到抑制。③同时敲除Notch和β-catenin可以更有效地抑制miR-135b过表达诱导的骨肉瘤细胞的干性和转移。MiR-135b过表达组中肿瘤干细胞亚群比例最高，Notch1或β-catenin沉默组的肿瘤干细胞比例有所下降，Notch1和β-catenin同时沉默组的肿瘤干细胞比例最低。④骨肉瘤细胞中miR-135b表达与其靶基因TET3、GSK3β、β-TrCP、CK1α和APC的表达呈负相关。TET3、GSK3β、β-TrCP、CK1α和APC的mRNA和蛋白表达水平在miR-135b沉默的MNNG/HOS细胞中均显著升高。⑤miR-135b直接与靶基因的3'非编码区相结合。在miR-135b过表达的骨肉瘤细胞中，包含原型3'UTR的质粒的荧光素酶活性显著减低。但含突变3'UTR的质粒的荧光素酶活性并不发生变化。⑥MiR-135b通过TET3等靶基因激活Notch和Wnt/β-catenin信号通路。单独转染TET3、CK1α、β-TrCP、APC和GSK3β可以部分抑制miR-135b过表达骨肉瘤细胞中miR-135b诱导的Wnt/β-catenin信号通路激活。⑦抑制miR-135b可以有效抑制裸鼠体内骨肉瘤肿瘤干细胞导致的肺转移和复发。抑制miR-135b可完全抑制裸鼠体内肿瘤干细胞诱导的肿瘤形成，而对照组并没有影响到肿瘤干细胞诱导的肿瘤形成。单独使用顺铂治疗，可使肿瘤缩小，但在治疗结束12天后出现复发。而联合使用顺铂和miR-135b抑制剂进行治疗组未出现复发。在治疗4个周期之后，联合治疗组与单独使用顺铂治疗组及对照组相比，肿瘤干细胞的数量显著下降。第三部分:①MiR-135b高表达是患者预后不良的危险因素。miR-135b表达水平高的肿瘤患者总体生存率和无病生存率均低于miR-135b低水平组。②MiR-135b与TET3、CK1α和GSK3β之间呈明显负相关，而与Notch1和β-catenin的表达呈正相关。Notch1和/或β-catenin的高表达与骨肉瘤患者预后较差呈强相关性。但与体外实验结果不同，miR-135b与APC和β-TrCP之间并不存在相关。 结论:①miR-135b在骨肉瘤组织中呈异常高表达，且在转移灶中表达要高于原发灶，在高转移性细胞系中表达要高于低转移性细胞系。②miR-135b通过抑制TET3、CK1α和GSK3β激活Notch和Wnt/β-catenin信号通路，进而对骨肉瘤肿瘤干细胞的干性产生影响，促发骨肉瘤的转移和复发。③抑制miR-135b可以抑制骨肉瘤的转移和复发，说明miR-135b可能是一种新的骨肉瘤治疗潜在靶标。
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