不同抗原表位CART-30细胞对经典型霍奇金淋巴瘤细胞株的杀伤作用及优化研究

摘要

经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin's lymphoma，cHL)是霍奇金淋巴瘤的病理类型之一，是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，主要发生于年轻及老年患者。目前常规化疗疗效较好，但难治/复发型cHL仍缺少有效的治疗方法，因此如何减少并发症、优化、个体化治疗成为目前研究重点。嵌合抗原受体修饰的T细胞（chimeric antigen receptor-modified T cell，CART）是近年来迅速发展的免疫治疗领域的研究热点。目前靶向性针对CD30-CART细胞免疫治疗在我院临床治疗工作中已收获一定成就，但疗效仍待进一步优化。
　　目的：本研究选择不同抗原表位的两种单克隆抗体Ki-4及Ber-H2，优化性构建不同的CAR基因片段的载体，比较两种CART细胞对CD30阳性的cHL细胞系L428的杀伤作用，以及其机制与NF-κB信号通路相关性进行研究。
　　方法：①构建携带不同抗原表位的CD30-CAR基因片段的慢病毒载体;②两种不同抗原表位的CART-30细胞的培养;③两种不同抗原表位CART-30细胞对cHL细胞株的杀伤效率的比较;④CD30-CARs对cHL细胞株NF-κB机制的影响。
　　结果：①成功构建出不同抗原表位的CD30-CART细胞，阳性率平均值约为65.7％左右;②Ki-4组效靶比为1∶1时杀伤效率的平均值为35.15％，效靶比为10∶1时杀伤效率的平均值为66.99％;Ber-H2组效靶比为1∶1时杀伤效率的平均值为31.95％，效靶比为10∶1时杀伤效率的平均值为56.11％;CD19组效靶比为1∶1时杀伤效率的平均值为21.92％，效靶比为10∶1时杀伤效率的平均值为45.49％;CIK组效靶比为1∶1时杀伤效率的平均值为16.99％，效靶比为10∶1时杀伤效率的平均值为32.22％。P＜0.05，不同效应细胞间及不同效靶比间的杀伤效应均有差异，且此差异具有统计学意义。③Wester蛋白印迹法结果示：TNF-α组及Ki-42h及3h组P-P65呈强阳性，IκBα蛋白呈弱阳性;而空白对照组、Ki-4的0h且及Ber-H2各组P-P65及IκBα蛋白均呈现弱阳性。
　　结论：①不同抗原表位的CD30-CART细胞对经典型霍奇金淋巴瘤细胞杀伤作用不同;②Ki-4的scFv能有效激活NF-κB信号通路，但Ber-H2-CARs不能激活NF-κB信号通路。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 不同抗原表位抗体质粒的克隆及慢病毒包装

1．材料和方法

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器设备

1．3 含目的基因慢病毒质粒的克隆、提取及保存

1．4 293T细胞的培养方法

1．7 倒置荧光显微镜下观察CARs的表达

2．结果

第二部分 两组靶向CD30-CART细胞的制备和流式检测

1．材料和方法

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器设备

1．3 Anti-CD30-CART细胞的制备和培养

1．4 人原代T细胞免疫表型测定

1．5 流式细胞术测定anti-CD30-CAR的表达

2．结果及统计学分析

2．1 人原代T细胞免疫表型流式细胞计数检测结果

2．2 流式细胞术检测pWPT-GFP CART细胞阳性表达率

2．3 统计学分析各平行试验组感染效率情况

第三部分 靶向CD30-CART细胞表达优化对cHL细胞系的杀伤影响

1．材料和方法

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器设备

1．3 细胞系的选择及L428细胞的培养方法

1．4 两种CD30-CART细胞对L428细杀伤活性检测

2．结果及统计学分析

2．1 流式细胞术检测不同效靶比效应细胞杀伤效率

2．2 统计学分析各平行试验组感染效率情况

第四部分CD30-CARs对L428细胞NF-κB影响

1．材料和方法

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器设备

1．3 质粒的转染及蛋白的提取

1．4 Western Blot法测定不同抗原表位CARs对L428细胞的NF-κB通路蛋白表达的影响差异

2．结果

讨论

参考文献

结论

文献综述

中英文缩略词对照

攻读硕士学位期间发表文章情况

致谢