苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因及几丁质酶基因的克隆与特征分析

摘要

该论文设计了两对引物,应用PCR技术分别从BT sotto质粒DNA和Btisraelensis基因组DNA中扩增得到杀虫晶体蛋白cry1Aa13基因和几丁质酶ichi基因,并进行了序列分析和功能预测.主要研究结果如下:1.建立了苏云金芽孢杆菌大型质粒DNA的小量提取方法.该方法可有效去除染色体DNA及RNA,省略了苯酚和氯仿抽提过程,不用担心痕量酚对质粒DNA质量的影响.2.根据cry1A基因保守序列设计引物,利用PCR技术扩增了杀虫晶体蛋白基因,该基因已在GenBank中登录,登录号为AF510713,目前已被Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Aa13.3.对cry1Aa13进行了生物信息学分析,发现该基因含有一个由3543bp组成的开放阅读框,编码1180个氨基酸,分子量约为133.50kDa.4.根据几丁质酶基因保守序列设计引物,利用PCR技术扩增了几丁质酶ichi基因,该基因已在GenBank中登录,登录号为AF526379.5.对ichi进行了生物信息学分析,发现该基因序列全长为2570bp,包括启动子、编码区和终止子序列,是一个完整的基因.其中编码区由一个2067bp的开放阅读框(ORF)组成,编码688个氨基酸,推测分子量为75.79 kDa,等电点pI=5.90.Ichi由分泌信号肽(46AA)、催化区 (105AA)、粘蛋白Ⅲ型同源区(74AA)和几丁质结合区(40AA)4个结构域组成.

目录

一、文献综述(Mini review)

1.1苏云金芽孢杆菌研究现状

1.1.1细菌杀虫剂的研究进展

1.1.2苏云金芽孢杆菌的形态特征及分类

1.1.3杀虫晶体蛋白基因的克隆及分类

1.1.4杀虫晶体蛋白基因的基本结构特征

1.1.5杀虫晶体蛋白的结构

1.1.6伴胞晶体的杀虫机制及昆虫对伴胞晶体的抗性

1.2细菌几丁质酶研究现状

1.2.1细菌几丁质酶的研究历史

1.2.2几丁质酶的多样性及其产生条件

1.2.3几丁质酶的理化性质及作用机理

1.2.4细菌几丁质酶的结构

1.2.5细菌几丁质酶基因的结构

1.2.6细菌几丁质酶对害虫的防治及其增效机理

二、引言(Introduction)

三、材料与方法(Materials and Methods)

3.1实验材料

3.1.1菌种和质粒

3.1.2主要试剂

3.2实验方法

3.2.1苏云金芽孢杆菌质粒DNA的提取

3.2.2大肠杆菌质粒DNA的小量提取

3.2.3苏云金芽孢杆菌基因组DNA的提取

3.2.4 DNA纯度及浓度的测定

3.2.5 DNA限制性内切酶反应

3.2.6 DNA片段的回收

3.2.7 DNA片段的连接

3.2.8大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

3.2.9重组克隆的筛选及鉴定

3.2.10引物的设计

3.2.11目的基因的聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)

3.2.12扩增产物的序列分析

四、结果与分析(Results and Analysis)

4.1质粒DNA浓度及纯度的测定

4.2 cry1Aa13基因的克隆

4.3 ichi基因的克隆

4.4重组质粒的验证

4.5 cry1Aa13的序列分析

4.6 ichi的序列分析

五、讨论(Discussion)

5.1苏云金芽孢杆菌大型质粒DNA的提取

5.2 cry1Aa13基因及其功能

5.3 ichi基因及其功能

5.4 Cry1Aa13与Ichi的后续研究

六、结论(Conclusion)

参考文献(References)

附录1 缩略语表（Abbreviation）

附录2 硕士学习期间发表的论文、登录的基因及参加的科研项目

致谢