抗人大肠杆菌免疫鸡蛋黄抗体的研究

摘要

高免蛋黄抗体具有生产过程简单、效率高等特点,已越来越多地应用于人类许多疾病的预防和治疗以及生物学的高度特异性检测等领域中,并取得显著成效.本文主要研究了以人致病性大肠杆菌为抗原,免疫母鸡,研究获得含有高效价蛋黄抗体的鸡蛋的最佳条件;建立快速、准确、定量的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定蛋黄抗体(IgY)效价的技术;研究抗人大肠杆菌IgY分离纯化条件及其理化、生化特性;研究食品加工过程中的各种因素对大肠杆菌特异IgY生物活性的影响;探讨抗人大肠杆菌免疫鸡蛋抗体的功能及其机理;评估蛋黄抗体的安全性.主要获得如下结果:(1)对获得含有高效价蛋黄抗体的鸡蛋的最佳条件研究:(2)采取热酚法提取E. coli LPS作为抗原,以酶标记的兔抗鸡IgY抗抗体(IgG)为二抗建立起来的间接ELISA技术检测特异蛋黄抗体IgY的抗体效价,以酶标二抗工作浓度为1:2000,LPS抗原包被浓度为1:20(10ug/m1),可以检测到鸡特异IgY抗体效价为1:10240.用猪源EHEC和人源沙门氏菌的LPS抗原进行了交叉检测,表现出高度的特异性.(3)通过对蛋黄抗体(IgY)的分离纯化条件研究发现,乙醇沉淀抗体的最佳条件是粗提液:乙醇(V/V)为1:0.35;经DEAE-Sephrose fast-flow离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶排阻层析连续纯化后可得到电泳纯的抗人大肠杆菌IgY,其MW为186400Da(电泳法)或186500Da(凝胶过滤法),该抗体由两个亚基构成,分子质量分别为65900Da和24600Da,其等电点为5.5.(4)通过稳定性研究:(5)通过对抗人大肠杆菌免疫蛋黄抗体的功能及其机理探讨发现,抗人大肠杆菌卵黄抗体浓度大于5mg/ml,可对大肠杆菌有明显的体外抑菌作用;抗人大肠杆菌IgY对大肠杆菌诱导的乳鼠肠道感染具有显著的预防和治疗作用;抗人大肠杆菌卵黄抗体可抑制大肠杆菌对肠上皮细胞粘附作用,随着大肠杆菌浓度的不断升高,粘附率不断增加,上皮细胞浓度的增加能提高ETEC对其的粘附率.(6)研究发现,4.0 kGy的<'60>Co γ射线可使蛋中可能污染的微生物全部灭活,而不影响抗体活性;鸡抗人大肠杆菌抗体对临床检查、血液学、生化学、器官重量、系数及组织病理学等指标无明显影响,证明鸡蛋黄抗体IgY无急、慢性毒副作用;通过骨髓嗜染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验及Ames试验,结果证明鸡抗人大肠杆菌抗体无细胞毒,无致突变作用.

目录

文摘

英文文摘

缩写词

第一章鸡蛋综合利用及蛋黄抗体研究进展

1前言

2我国蛋品加工概况

3鸡蛋的结构与组成

4鸡蛋中的有效成分及利用

4.1蛋壳和蛋壳膜

4.2蛋清

4.3蛋黄

5蛋黄抗体(IgY)

5.1蛋黄抗体(IgY)的形成与转运

5.2 IgY的分子结构及生物学特性

5.3 IgY的稳定性

5.4 IgY的制备

5.5 IgY的应用

6本课题的目的意义及主要研究内容

6.1本课题的目的意义

6.2本课题研究的主要内容

参考文献

第二章免疫鸡蛋的制备

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2试验方法

3结果与分析

3.1免疫剂量对免疫蛋抗体效价的影响

3.2不同免疫佐剂对免疫蛋抗体效价的影响

3.3不同免疫部位和方式对免疫蛋抗体效价的影响

3.4不同强化免疫程序对免疫蛋抗体效价的影响

4讨论

5结论

参考文献

第三章ELISA检测E.coli LPS特异IgY方法的建立

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2试验方法

3结果与分析

3.1酶标抗体工作浓度的确定

3.2抗原包被浓度

3.3问接ELISA检测结果阴、阳性临界值的确定

3.4特异性试验结果

3.5敏感性试验结果

4结论

参考文献

第四章免疫鸡蛋抗体的分离纯化及基本理化特性研究

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2试验方法

3结果与分析

3.1免疫蛋抗体的乙醇分级沉淀

3.2卵黄抗体的DEAE-Sepharose层析纯化

3.3卵黄抗体的Sephacryl S-200凝胶层析纯化

3.4纯化后卵黄抗体的纯度鉴定

3.5卵黄抗体分离纯化工艺评价

3.6卵黄抗体的分子质量和亚基确定

3.7免疫蛋抗体的等电点

3.8免疫蛋黄抗体氨基酸组成分析

4讨论

5结论

参考文献

第五章免疫鸡蛋抗体的稳定性研究

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2试验方法

3结果与分析

3.1蛋黄抗体的温度稳定性

3.2 pH对蛋黄抗体活性的影响

3.3蛋白酶对蛋黄抗体活性的影响

3.4蛋黄抗体的肠道稳定性

3 5贮藏对蛋黄抗体活性的影响

3.6冷冻干燥对蛋黄抗体活性的影响

3.7食物成分对卵黄抗体在各种条件下稳定性的影响

4讨论

5结论

参考文献

第六章抗人大肠杆菌免疫鸡蛋抗体的功能及其机理探讨

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2试验方法

3结果与分析

3.1卵黄抗体的体外抑菌作用

3.2大肠杆菌乳鼠感染模型的建立

3.3蛋黄抗体对肠道感染的预防作用

3.4蛋黄抗体对肠道感染的治疗作用

3.5蛋黄抗体对大肠杆菌对肠道上皮细胞粘附作用的影响

3.6蛋黄抗体对大肠杆菌对肠道黏膜粘附作用的影响

4讨论

5结论

参考文献

第七章免疫鸡蛋的安全性评价

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.2试验方法

3结果与分析

3.1不同辐照剂量的60Co γ射线灭活效果

3.2免疫蛋抗体的急性毒性实验

3.3免疫蛋抗体的慢性毒性实验

3.4鸡抗大肠杆菌卵黄抗体的致突变作用

4讨论

5结论

参考文献

结论与展望

致谢