电针镇痛的累积效应与下丘脑、海马胆碱能神经元关系的研究

摘要

研究背景
　　 针刺治疗疾病具有累积效应现在已是众多研究者所公认的事实。但是目前关于针刺累积效应的具体机理尚不明确,未见到系统的研究报道。已有的动物实验结果表明:反复针刺所产生的累积效应与神经系统的特别是中枢神经系统对针刺信息的储存、编码等活动密切相关;下丘脑、海马等边缘系统、中枢胆碱能系统参与针刺镇痛的过程。我们实验室前期的工作证明大鼠下丘脑、海马囊泡乙酰转移酶(VAChT)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)等参与针刺镇痛的累积效应；去卵巢(OVX)引起的记忆功损伤减弱了针刺的效应。为了从不同的环节进一步确认下丘脑、海马胆碱能神经元在针刺累积性镇痛效应中的作用,本研究在结扎坐骨神经造成压迫性损伤(chronic constrictive injury,CCI)/及OVX大鼠记忆损害的动物模型上,从乙酰胆碱降解酶胆碱酯酶(AChE)和细胞内蛋白激酶PKA的活性的改变、以及毒蕈碱M1受体m RNA表达的变化,探讨针刺累积效应的机制。
　　 研究方法
　　 Wistar雌性大鼠103只,随机分为正常对照组(n=15),慢性压迫损伤(CCI)组(n=15),CCI+EA2天(D)组(n=15),CCI+EA2周(W)组(n=15),去卵巢(OVX)+CCI(n=13),OVX+CCI+EA2D(n=15),OVX+CCI+EA2W(n=15)组。Morris水迷宫测试检查OVX+D-半乳糖皮下注射动物学习记忆能力的变化。结扎坐骨神经造成CCI慢性痛模型,电针双侧“足三里”-“阳陵泉”穴(2/15Hz,1-2mA,1次/D)。用辐射热照射大鼠双侧足底引起的缩腿反应潜伏期(PWL)的差值作为痛敏分数(HS)判断动物的痛反应。在麻醉状态下,一部分(每组8—10例)动物常规灌流取脑,冰冻切片,用酶组织化学方法来检测下丘脑弓状核(ARC)区、视上核(SON)区和室旁核(PVN)区,及海马CA1区AChE的表达；用免疫组化法检测其PKA活性。另一部分动物(每组5例)取脑组织匀浆后,用RT—PCR的方法来检测M1受体m RNA的表达的变化。
　　 结果：
　　 1)电针对CCI大鼠痛阈变化的影响
　　 CCI术18天后,与正常组(0.22±0.68)比较,各组HS的绝对值都明显升高(P<0.05)。在单纯CCI动物上,与CCI对照组(-4.22±0.33)比,CCI术后第18天CCI+EA2D(-2.76±0.32)、CCI+EA2W组(-0.42±0.68)HS的绝对值显著减小(P<0.05)；CCI+EA2W组(-0.42±0.68)HS绝对值明显低于CCI+EA2D组(-2.76±0.32,P<0.05)。在OVX动物上,OVX+CCI+EA2W组(-2.37±0.29)和CCI+EA2D组(-3.11±0.32)HS绝对值明显低于OVX+CCI组(-4.66±0.45,P<0.05):OVX+CCI+EA2W组HS绝对值(-2.37±0.29)明显低于CCI+EA2D组(-3.11±0.32,P<0.05)。提示电针可以改善CCI动物的痛敏状态,并具有累加性。CCI+EA2W组HS的绝对值(-0.42±0.68)显著低于OVX+CCI+EA2W组(-2.37±0.29,P<0.05),说明记忆损伤动物的电针累积效应明显降低。
　　 2)电针对CCI大鼠下丘脑三核团、海马组织胆碱能神经纤维AChE的活性变化的影响:
　　 坐骨神经结扎后,CCI组ARC(144.43±4.68)、SON(135.14±6.95)AChE的表达显著少于正常对照组ARC(126.27±4.35)、SON(122.2±7.5)(P<0.05,灰度值越小,表达量越大)。电针2天后,CCI+EA2D组AChE的表达在ARC(133.32±8.03)、SON(111.24±6.01)显著增多(P<0.05)。CCI+EA2W组下丘脑AChE的表达PVN(100.11±12.71)、ARC(117.25±4.12)和SON区(95.27±7.23)显著多于CCI对照组和CCI+EA2D组(P<0.05)。复合模型组中的表达趋势与单纯CCI模型组相同,电针后AChE的表达累积性上调。OVX+CCI+EA2W组AChE的表达ARC(133.23±11.48)、和SON区(113.92±7.11)均显著少于CCI+EA2W组同一脑区(P<0.05)。海马CA1区各组AChE的表达与下丘脑区各组的表达趋势一致。结果说明:CCI后,下丘脑和海马组织AChE的活性有所抑制,电针可使AChE的活性增强,并有累积性上调；去除卵巢,动物记忆能力受到损害后,仍有累积效应存在,但明显减弱。
　　 3)电针对CCI大鼠下丘脑、海马组织毒蕈碱Ml受体mRNA表达的影响
　　 CCI后,下丘脑组织M1受体mRNA的表达量(0.39±0.25)与正常对照组(0.83±0.40)比较显著性降低(P<0.05)； CCI+EA2W组M1受体mRNA表达量(0.88±0.16)显著高于CCI对照组(0.39±0.25)和CCI+EA2D组(0.59±0.21,P<0.05)。记忆损伤动物中,OVX+CCI组下丘脑M1受体mRNA的表达量(0.29±0.11)明显少于正常对照组(0.83±0.40,P<0.05)；OVX+CCI+EA2W组M1受体mRNA的表达量(0.76±0.35)显著高于OVX+CCI(0.29±0.11)和OVX+CCI+EA2D组(0.41±0.22,P<0.05)。这说明电针可以累积性上调M1受体mRNA的表达。海马区M1受体mRNA的表达趋势与下丘脑区的表达变化趋势类似；OVX+CCI+EA2W组(1.00±0.20)M1受体mRNA的表达显著少于CCI+EA2W(1.37±0.37),提示电针上调M1受体mRNA表达的累积作用记忆损伤后减弱。
　　 4)电针对CCI大鼠下丘脑三核团、海马CA1区神经元PKA的表达变化的影响
　　 CCI+EA2W组下丘脑PVN(99.28±19.33)、ARC(100.18±14.52)和SON(103.26±17.12)区PKA的表达均明显高于正常对照组PVN(133.54±6.31),ARc(127.84±18.91),SON(133.53±21.34)(P<0.05；灰度值越小,表达量越大),也显著高于CCI+EA2D组PVN(124.35±6.3),ARC(121.77±14.66),SON(118.61±9.64,P<0.05)。OVX+CCI+EA2W组PVN(107.48±12.39)、ARC(117.11±19.87)和SON(129.12±16.96)区PKA表达亦均明显高于OVX+CCI组PVN(145.96±8.02),ARC(134.24±18.43),SON(148.42±10.7(P<0.05),说明EA2W可使PKA的表达显著上调,且有累积性作用。OVX+CCI+EA2W组ARC和SON区PKA的表达均显著低于CCI+EA2W组(P<0.05),提示EA上调PKA表达的累积效应在记忆功能减退的动物上明显减弱。海马PKA的表达与SON等下丘脑核团PKA的表达趋势类似。
　　 结论：
　　 1)电针“足三里”-“阳陵泉”可明显减轻CCI后出现的痛反应,且有累积效应；记忆损伤后减弱电针的效应；
　　 2)电针可显著减轻CCI引起的下丘脑、海马AChE、毒蕈碱M1受体mRNA表达的抑制作用,累积性上调AChE、PKA及M1受体mRNA的表达；记忆损伤后电针的上述效应降低。
　　 因此,电针“足三里”-“阳陵泉”减轻慢性痛的累积效应与其上调下丘脑和海马组织中AChE、M1受体mRNA、PKA的表达作用、与动物神经记忆功能有密切联系。本研究结果为反复针刺治疗产生的累积效应提供了系统而详实的实验依据。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词表

文献综述

1 针刺累积的效应临床与实验研究现状

2 下丘脑一海马在针刺镇痛中的作用机制

3 乙酰胆碱神经系统与记忆、针刺镇痛关系的研究

参考文献:

前言

第一部分 电针镇痛累积效应的观察及记忆损伤后对针刺效应的影响

前言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 实验结果

2.1 Morris水迷宫实验结果

2.2 热辐射痛阈

3 讨论

3.1 电针治疗坐骨神经痛时参数的选择

3.2 动物模型的建立

3.3 实验结果的分析

4 小结

第二部分 针刺镇痛的累积效应与下丘脑、海马胆碱能神经系统关系

前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 实验结果

2.1 电针对乙酰胆碱酯酶的表达的影响

2.2 电针对下丘脑、海马组织毒蕈碱M1受体mRNA的表达的影响

3 讨论

3.1 慢性痛对AChE和mRNA表达的影响

3.2 记忆损伤对AChE和M1受体mRNA表达的影响

3.3 电针对AChET M1受体mRNA表达的影响

3.4记忆对累活效应的影响

4 小结

第三部分 针刺镇痛累积效应与下丘脑、海马的PKA活性变化的关系

前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 实验结果

2.1 电针对下丘脑三核团PKA的表达的影响

2.2 电针对海马CA1区PKA表达的影响

3 讨论

3.1 PKA信号转导系统

3.2 蛋白激酶A与记忆、疼痛的关系研究

3.3 实验结果分析

4 小结

总结

参考文献

致谢

附图