滋补肝肾、行气活血类中药延缓线虫衰老的作用及分子机制研究

摘要

研究背景
　　 21世纪是人口老龄化时代,人口老龄化和增长过快给社会经济、文化、教育、医疗、保健等都带来了巨大的压力和挑战。因此,探索衰老的内涵,寻找有效的延缓衰老的方式,是当前重要且紧迫的任务。衰老研究主要包括衰老机制研究和延缓衰老药物研究。迄今为止,解释衰老机理的学说多达200余种,其中包括:自由基损伤说、神经内分泌紊乱说、代谢学说、线粒体损伤学说、限食理论等。然而归根结底,上述学说都受基因表达调控的影响,任何一种衰老学说都有与之相对应的基因表达改变,可以在基因水平将各种学说统一起来研究衰老及药物对衰老的影响。
　　 中医药学在长期实践中形成了独特的衰老理论,并在此基础上发现了许多具有延年益寿功效的中药,具有很大的研究价值。中医肝、肾与衰老关系密切,肾虚是衰老之本,肝虚是衰老之助。二至丸为临床常用的滋补肝肾的名方,现代研究证实其确有延缓衰老作用,需要进一步探讨其分子机制。“气滞血瘀”也是人体衰老的主要机制之一。行气活血方剂能改善微循环、提高免疫、提高应激能力等,从而延缓衰老。川芎为活血行气之要药,临床应用广泛,具有改善微循环、调节免疫等多种药理作用,显示了良好的延缓衰老作用,值得进行深入研究。
　　 秀丽隐杆线虫因其寿命周期短、廉价易培养、子代数目多、细胞数目简单、遗传背景清楚等优点已成为良好的衰老研究的实验动物。
　　 本课题以线虫为研究对象,首先对传统中医或临床实践认为可以延缓衰老的30多种中药及其有效成份进行寿命实验的筛选研究,筛选出能延寿的及其最佳延寿浓度(以滋补肝肾中药-二至丸、行气活血中药-川芎为代表),并进一步观察上述药物对线虫繁殖力和急性热应激能力的影响。在此基础上,采用realtimeRT-PCR技术检测分析上述中药对不同衰老学说涉及的衰老/长寿基因表达的影响,探讨并比较分析两类中药延缓衰老作用在分子机制上的异同。
　　 实验研究
　　 1延缓线虫衰老中药筛选
　　 建立了中药及其有效成分直接添加入线虫培养基的中药干预线虫培养方法及寿命实验筛选的方法,并对30多种中药及其有效组分进行了延长线虫寿命作用的筛选,发现7种药物具有延寿或延寿趋势。以滋补肝肾中药复方-二至丸、行气活血中药-川芎提取物为代表。
　　 2二至丸(EZW)对线虫衰老的影响及分子机制研究
　　 发现二至丸水提液具有较好的延长线虫寿命的作用,以500mg/L浓度组为最佳,线虫平均寿命延长10.6％(P<0.01),最大寿命延长16.2％(P<0.01)；二至丸水提液能一定程度的提高线虫的急性热应激能力,不影响其繁殖力。采用实时荧光定量RT-PCR方法发现二至丸延缓衰老作用与调控ⅡS信号通路、神经内分泌、生物钟等多个途径的基因表达有关。
　　 3川芎提取物(CXE)对线虫衰老的影响及分子机制研究
　　 发现川芎提取物具有较好的延长线虫寿命的作用,以25mg/L浓度组为最佳,线虫平均寿命延长29.9％(P<0.01),最大寿命延长9.4％(P<0.01)；川芎提取物能一定程度的提高线虫的急性热应激能力,不影响其繁殖力。采用实时荧光定量RT-PCR方法研究其延缓衰老的分子机制,发现在衰老自然进程中,线虫体内与衰老关系密切的ⅡS信号通路和限食通路的基因表达发生变化——衰老基因的表达量开始增加,而长寿基因的表达量开始减少。川芎提取物通过调控ⅡS信号、抑制脂肪积累、提高线粒体活性等与能量代谢有关的基因和抗氧化应激等多个生理生化途径共同影响线虫的生理机能,发挥延缓衰老的功效。
　　 总结
　　 本研究采用适合大规模药物筛选和机制研究的模式生物线虫对30多种中药及其有效成分进行了寿命实验筛选,共筛选出7种具有延寿或延寿趋势的药物,以滋补肝肾中药复方-二至丸和行气活血中药川芎为代表。
　　 二至丸和川芎水提液均能延长线虫寿命、提高应激能力,不影响其繁殖力。两药延缓衰老的分子机制上存在异同点,相同点是上述两药物均能调控ⅡS信号通路,促进“长寿基因”表达,抑制“衰老基因”表达；不同点在于除ⅡS外,二至丸还调控神经内分泌、生物钟等途径,而川芎提取物主要调控与能量代谢有关的基因,如限食通路、线粒体活性、脂肪积累等。
　　 因此,有延缓衰老作用的不同中药具有不同的分子靶点和作用机制,能否利用这一特点从分子靶点入手在中医理论指导下进行各类中药的药效及中药的组分再配伍研究有必要在今后的工作中进行进一步探索。
　　 本研究将多种衰老学说统一到基因水平进行研究,更有助于观察各衰老理论的相互关系和调控网络,有利于寻找真正有效的衰老功能基因群,更好地为延缓衰老药物的机制研究和新药开发服务。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

文献综述

综述1 肾虚致衰老的现代研究进展

参考文献

综述2 进化保守通路长寿分子机制研究进展

参考文献

综述3 中药延缓衰老作用机制的现代研究进展

参考文献

前言

1 滋补肝肾类中药延寿的理论基础及二至丸益寿的研究概况

2 行气活血类中药延寿的理论基础及川芎益寿的研究概况

3 滋补肝肾、行气活血类中药延寿的分子机制研究进展

4 秀丽隐杆线虫在衰老研究中的优势

实验研究

1 延缓线虫衰老中药筛选

1.1 目的

1.2 材料

1.3 方法

1.4 结果

讨论

小结

2 二至丸(EZW)对线虫衰老的影响及分子机制研究

2.1 EZW水提液及含药血清对线虫寿命的影响

2.2 EZW水提液对线虫繁殖力的影响

2.3 EZW水提液对线虫急性热应激能力的影响

2.4 EZW水提液延缓线虫衰老的分子机制研究

讨论

小结

3 川芎提取物(CXE)对线虫衰老的影响及分子机制研究

3.1 CXE对线虫寿命的影响

3.2 CXE对线虫繁殖力的影响

3.3 CXE对线虫急性热应激能力的影响

3.4 CXE延缓线虫衰老的分子机制研究

讨论

小结

结论和创新点

结论

创新点

参考文献

致谢

攻读博士学位期间主持课题、发表论文和受理专利