中药甲亢宁胶囊对FRTL-5细胞TSHR信号转导通路的作用机制研究

摘要

目的:
　　1.探讨甲亢宁对TSHR胞内信号转导通路的影响。
　　2.探讨甲亢宁治疗甲亢的作用机制与促进细胞凋亡的关联性。
　　方法:
　　1.我们采用MTT法检测了甲亢宁的不同浓度及作用时间对FRTL-5细胞的影响，探索甲亢宁的量效和时效关系，从而确定甲亢宁的浓度及作用时间。
　　2.我们采用荧光倒置显微镜观察经过甲亢宁干预后FRTL-5细胞的形态，并采用CCK-8法检测甲亢宁干预后FRTL-5细胞增殖的情况。
　　3.我们采用流式细胞技术检测了甲亢宁对FRTL-5细胞凋亡的影响。
　　4.我们采用放免法检测甲亢宁干预后FRTL-5细胞上清液中cAMP的含量。
　　5.我们采用Western Blot检测了甲亢宁干预后FRTL-5细胞TSHR信号转导通路相关蛋白的表达。
　　结果:
　　1.甲亢宁的量效和时效关系
　　甲亢宁具有抑制细胞增殖的作用，而且随着浓度的增加、时间的延长，其抑制作用越强。甲巯咪唑则无抑制细胞增殖的作用。由此我们选定甲亢宁和甲巯咪唑的浓度和作用时间为3mg/ml甲亢宁、10ug/ml甲巯咪唑，作用时间为24h。
　　2.甲亢宁对FRTL-5细胞增殖的影响
　　①甲亢宁作用于FRTL-5细胞形态学观察:基线组细胞数量少;体积略小;培养液中漂浮有细胞碎片。模型组细胞数量明显增多;细胞体积大，细胞轮廓清晰，形态饱满;可见伪足样胞质突起;胞浆内可见黑色点状颗粒;高倍镜下清晰可见细胞核，核浆比大，细胞核为圆形，可以见到核仁。甲亢宁组细胞数量明显减少，细胞固缩，体积变小;胞浆内出现空泡;不能清晰的分辨出细胞核和核仁。甲巯咪唑组细胞数量明显多;细胞体积大，细胞轮廓清晰，形态饱满;可见伪足样胞质突起;胞浆内可见黑色点状颗粒;高倍镜下清晰可见细胞核，核浆比大，细胞核为圆形，可以见到核仁。
　　②甲亢宁对FRTL-5细胞增殖的影响:采用CCK-8法检测了各组FRTL-5细胞的OD值，模型组(1.76±0.22)明显高于基线组(0.41±0.04)，P＜0.01;甲亢宁组(0.12±0.01)低于模型组(1.76±0.22)，P＜0.01;甲亢宁组(0.12±0.01)低于甲巯咪唑组(1.45±0.26)，P＜0.01;甲巯咪唑组与模型组差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　3.甲亢宁对FRTL-5细胞凋亡的影响
　　采用流式细胞技术检测了各组FRTL-5细胞的凋亡率，根据试剂盒中荧光染料与细胞的结合部位不同，可以将调亡分为早期凋亡及中晚期调亡。在细胞的早期凋亡率中，模型组(1.52±0.34)低于基线组(3.97±0.62)，P＜0.01;甲亢宁组(14.55±1.80)明显高于模型组(1.52±0.34)，P＜0.01;甲亢宁组(14.55±1.80)高于甲巯咪唑组(2.14±0.68)，P＜0.01;甲巯咪唑组与模型组差异没有统计学意义(P＞0.05)。在细胞的中晚期凋亡率中，各组之间差异无统计学意义。在细胞总凋亡率中，甲亢宁组(35.63±8.70)明显高于模型组(10.28±2.52)、甲巯咪唑组(9.05±1.96)，P＜0.01;甲巯咪唑组与模型组差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　4.甲亢宁对FRTL-5细胞cAMP释放量的影响
　　采用放免法检测了各组FRTL-5细胞上清液中cAMP的含量，模型组为(2.80±0.13 pmol/ml)高于基线组(1.88±0.09 pmol/ml)，P＜0.01;甲亢宁组为(2.54±0.10 pmol/ml)低于模型组(2.80±0.13 pmol/ml)，P＜0.05;甲亢宁组为(2.54±0.10 pmol/ml)低于甲巯咪唑组(2.79±0.07 pmol/ml)，P＜0.05;甲巯咪唑组与模型组差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　5.甲亢宁对FRTL-5细胞TSHR信号转导通路的影响
　　①甲亢宁对FRTL-5细胞PKAc蛋白表达的影响:采用Western Blot检测了各组FRTL-5细胞p-PKAc/PKAc蛋白表达，模型组(0.91±0.03)明显高于基线组(0.43±0.15)，P＜0.01;甲亢宁组(0.56±0.10)低于模型组(0.91±0.03)，P＜0.01;甲巯咪唑组(0.60±0.14)低于模型组(0.91±0.03) P＜0.05。
　　②甲亢宁对FRTL-5细胞Erk1/2蛋白表达的影响:采用Western Blot检测了各组FRTL-5细胞p-Erk1/2/Erk1/2蛋白表达，模型组(0.86±0.05)明显高于基线组(0.36±0.17)，P＜0.01;甲亢宁组(0.28±0.13)明显低于模型组(0.86±0.05)，P＜0.01;甲亢宁组(0.28±0.13)低于甲巯咪唑组(0.82±0.07)，P＜0.01;甲巯咪唑组与模型组差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　③甲亢宁对FRTL-5细胞PKCδ蛋白表达的影响:采用Western Blot检测了各组FRTL-5细胞p-PKCδ/PKCδ蛋白表达，模型组(0.88±0.13)明显高于基线组(0.47±0.33)，P＜0.01;甲亢宁组(0.56±0.16)低于模型组(0.88±0.13)，P＜0.05;甲巯咪唑组与模型组差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　④甲亢宁对FRTL-5细胞Akt蛋白表达的影响:采用Western Blot检测了各组FRTL-5细胞p-Akt/Akt蛋白表达，模型组(0.73±0.12)明显高于基线组(0.30±0.12)，P＜0.01;甲亢宁组(0.30±0.12)明显低于模型组(0.73±0.12)，P＜0.01;甲亢宁组(0.30±0.12)低于甲巯咪唑组(0.68±0.13)，P＜0.01;甲巯咪唑组与模型组差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　⑤甲亢宁对FRTL-5细胞mTOR蛋白表达的影响:采用Western Blot检测了各组FRTL-5细胞p-Akt/Akt蛋白表达，模型组(0.75±0.08)明显高于基线组(0.26±0.16)，P＜0.01;甲亢宁组(0.35±0.21)低于模型组(0.75±0.08)，P＜0.05;甲巯咪唑组与模型组差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　结论:
　　1.甲亢宁能下调FRTL-5细胞TSHR信号转导通路的PKAc、Erk1/2、 PKCδ、Akt、mTOR的表达，这可能是甲亢宁治疗Graves病的关键因素。
　　2.甲亢宁表现出明显的促进FRTL-5细胞凋亡的作用，这与下调TSHR信号转导通路相关蛋白的关联仍需进一步研究。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

第一部分 文献综述

TSHR胞内信号转导通路在Graves病发病机制的研究进展

甲状腺功能亢进症的中医药治疗进展

第二部分 导师魏军平教授治疗甲亢用药特点

第三部分 中药甲亢宁胶囊对FRTL-5细胞TSHR信号转导通路的作用机制研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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