益肾骨康方对裸鼠溶骨性骨转移瘤的干预作用机制研究

摘要

晚期恶性肿瘤比较容易转移于骨组织，疼痛是其主要症状，如果不及时治疗会发展至骨骼功能障碍、病理性骨折、骨髓功能抑制、高钙血症及瘫痪等因脊髓神经受压引起的严重并发症。治疗肺癌骨转移瘤主要是为减症治疗，其目的主要是维持患者一般生活工作，防止骨折，控制疼痛，改善生活质量，延长预期生存期。西药治疗有一定的毒副作用及成瘾性，因此中医中药以副作用小、疗效显著的特点在骨转移癌的治疗方面发挥重要的作用。
　　本研究分4部分:
　　一、左心室注射法裸鼠肺腺癌溶骨性骨转移癌模型的建立；
　　二、益肾骨康方对溶骨性骨转移瘤血清碱性磷酸酶的影响作用；
　　三、蛋白质印迹法检测扶正解毒化瘀中药益肾骨康方对溶骨性骨转移裸鼠基质来源趋化因子蛋白表达的调控作用；
　　四、蛋白质印迹法检测扶正解毒化瘀中药益肾骨康方对溶骨性骨转移裸鼠趋化因子受体蛋白表达的调控作用。
　　一、左心室注射法裸鼠肺腺癌溶骨性骨转移癌模型的建立
　　目的：本实验利用左心室注射法注射获得专利的人肺腺癌溶骨性骨转移细胞系CPA-YANG1BM，以建立溶骨性骨转移模型，并以此模型为基础，观测中药对其的干预作用。
　　方法：本实验研究使用了获得专利的人肺腺癌溶骨性骨转移细胞系CPA-YANG1BM，由上海交通大学附属胸科医院杨顺芳教授进行指导，使用左心室注射法建立裸鼠肺腺癌溶骨性骨转移模型。将裸鼠随机分为6组，每组6只，并于造模后第3天起给予药物干预。5周后经过micro SPECT/CT显像和病理切片统计各组裸鼠骨转移数，计算各组骨转移率及病理组织切片上肿瘤细胞数量与细胞总数的百分比。
　　结果：
　　1.帕米磷酸二钠组发现1个骨转移部位，其骨转移率为17％;益肾骨康方高剂量组发现4个骨转移部位，其骨转移率为50％;益肾骨康方中剂量组发现2个骨转移部位，其骨转移率为33％;而模型对照组出现了12个骨转移部位，其达到了百分之百的骨转移率;益肾骨康方低剂量组与中西药组没有发现骨转移部位，其骨转移率为零。
　　2.正常裸鼠骨皮质及骨小梁发育良好，正常的骨髓细胞充满髓内腔;模型对照组裸鼠可见肿瘤细胞几乎完全填充整个骨髓腔，骨小梁破坏极其明显，不见骨小梁结构，显微镜下可见多个实性癌细胞团及多个多核巨细胞（破骨样细胞）;可见皮质受损严重，呈大片缺损状，骨皮质明显变薄，而癌细胞在髓腔边缘呈活跃状态，骨小梁被损坏，癌细胞明显向外发展。低剂量益肾骨康方组及西药帕米膦酸二钠组裸鼠骨髓腔内少见多核巨细胞，髓腔内肿瘤细胞不见，未见骨皮质受损及骨小梁破坏;益肾骨康方高剂量组及中剂量组可见骨皮质、骨小梁受损程度比模型对照组明显减轻，髓腔内可见少量肿瘤细胞;可见中西药组裸鼠骨皮质受损，但仍较完整，髓腔内可见肿瘤细胞，骨皮质破坏及骨小梁受损在一定程度范围内。
　　结论：
　　1.成功培育人肺腺癌骨转移细胞株CPA-YANG1BM;
　　2.根据micro-Spect/CT显像结果显示，模型对照组均出现多个部位的骨转移，证实溶骨性骨转移造模成功;
　　3.根据病理组织切片结果显示，骨转移灶均为肺腺癌，证实溶骨性骨转移造模成功;
　　4.扶正解毒化瘀中药益肾骨康方可以减少裸鼠骨转移率，抑制骨转移部位增多;
　　5.扶正解毒化瘀中药益肾骨康方可以减轻骨转移灶的骨质损坏，降低裸鼠骨转移灶内肿瘤细胞与总细胞的比值。
　　二、益肾骨康方对溶骨性骨转移瘤血清碱性磷酸酶的影响作用
　　目的：本实验研究在前期工作的基础上深入探究益肾骨康方对血清碱性磷酸酶的影响作用。
　　方法：以肺腺癌溶骨性骨转移裸鼠模型为动物基础模型，使用酶免疫荧光法测定血清tALP，分别观测各组裸鼠血清碱性磷酸酶的数值。
　　结果：模型对照组裸鼠血清碱性磷酸酶平均水平高于正常值一倍，益肾骨康方中剂量组与模型对照组比较无统计学意义(P＞0.05)，益肾骨康方高剂量组及西药组血清碱性磷酸酶较模型对照组下降，与模型对照组相比有显著性差异(P＜0.05);益肾骨康方低剂量组、中西药组所测血清碱性磷酸酶与模型对照组相比有极显著性差异(P＜0.01);西药组、益肾骨康方高剂量组及益肾骨康方中剂量组血清碱性磷酸酶无显著性差异(P＞0.05)。上述结果表明益肾骨康方及帕米磷酸二钠能够降低溶骨性骨转移瘤裸鼠血清碱性磷酸酶。
　　结论：
　　1.扶正解毒化瘀中药益肾骨康方可以降低血清碱性磷酸酶的异常升高，以降低骨质破坏率，从而抑制骨转移的形成;
　　2.血清碱性磷酸酶可作为骨转移瘤的诊断、监测预后、化疗效果、手术效果评价的血清学检验指标。
　　三、蛋白质印迹法检测扶正解毒化瘀中药益肾骨康方对溶骨性骨转移裸鼠基质来源趋化因子蛋白表达的调控作用
　　目的：本实验研究在前期工作的基础上，深入探究益肾骨康方对溶骨性骨转移裸鼠CXCL12蛋白表达的调控作用。
　　方法：以肺腺癌溶骨性骨转移裸鼠模型为基础，采用蛋白质印迹法检测益肾骨康方对溶骨性骨转移裸鼠CXCL12蛋白的表达。并使用Image J图像分析软件进行图像分析。
　　结果：模型对照组、西药组CXCL12蛋白的表达较高，相比无显著性差异(P＞0.05);益肾骨康方高剂量组、中剂量组CXCR12蛋白的表达较低，与模型对照组相比有显著性差异(P＜0.05);益肾骨康方低剂量组与中西药组未发生骨转移瘤，CXCR12蛋白表达极低，与模型对照组相比有极显著性差异(P＜0.01);西药组与模型对照组骨转移瘤CXCL12蛋白的表达无显著性差异(P＞0.05);益肾骨康方高剂量组与中剂量组CXCR12蛋白的表达无显著性差异(P＞0.05)。上述结果表明益肾骨康方能够降低CXCL12蛋白的表达，而帕米磷酸二钠对CXCL12蛋白表达几乎没有降低作用。
　　结论：扶正解毒化瘀中药益肾骨康方可以通过抑制CXCR12的表达进而抑制骨组织对癌细胞的趋化作用，起到防止骨破坏的作用，从而抑制骨转移的发生。
　　四、蛋白质印迹法检测扶正解毒化瘀中药益肾骨康方对溶骨性骨转移裸鼠趋化因子受体蛋白表达的调控作用
　　目的：本实验研究以前期工作为基础，深入探讨扶正解毒化瘀中药益肾骨康方对溶骨性骨转移裸鼠CXCR4蛋白表达的调控作用。
　　方法：以肺腺癌溶骨性骨转移裸鼠模型为基础，采用蛋白质印迹法检测益肾骨康方对溶骨性骨转移裸鼠CXCR4蛋白的表达。并使用Image J图像分析软件进行图像分析。
　　结果：模型对照组、西药组、益肾骨康方高剂量组及中剂量组股骨转移瘤CXCR4蛋白的表达较高，与模型对照组相比无显著性差异(P＞0.05);益肾骨康方低剂量组骨转移瘤CXCR4蛋白几乎不表达，与模型对照组及其它组相比有显著性差异(P＜0.05)，中西医结合组CXCR4表达呈阴性结果，与模型对照组及其它各组组相比有极显著性差异(P＜0.01)。上述结果表明益肾骨康方能够降低CXCR4蛋白的表达，但与其剂量关系极大，而帕米磷酸二钠对CXCR4蛋白表达几乎没有下调作用。
　　结论：扶正解毒化瘀中药益肾骨康方可以通过抑制CXCR4的表达进而抑制骨组织对癌细胞的趋化作用，起到防止骨破坏的作用，从而抑制骨转移的发生。

目录

声明

摘要

英文缩略语表

第一部分 文献综述

综述一 肺癌骨转移机制的研究进展

参考文献

综述二 肺癌骨转移瘤的中西医治疗进展现状

参考文献

第二部分 实验研究

前言

1 左心室注射法裸鼠肺腺癌溶骨性骨转移癌模型的建立

1．1 材料和方法

1．2 实验结果

1．3 讨论

1．4 结论

参考文献

2 扶正解毒化瘀中药益肾骨康方对溶骨性骨转移瘤血清碱性磷酸酶的影响作用

2．1 材料和方法

2．2 统计学方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

3 蛋白质印迹法检测扶正解毒化瘀中药益肾骨康方对溶骨性骨转移裸鼠基质来源趋化因子蛋白表达的调控作用

3．1 材料和方法

3．2 统计学方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 结论

参考文献

4 蛋白质印迹法检测扶正解毒化瘀益肾骨康方对溶骨性骨转移裸鼠趋化因子受体蛋白表达的调控作用

4．1 材料和方法

4．2 统计学方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

4．5 结论

参考文献

致谢

个人简历