基于炎症消散的参莲提取物抗动脉粥样硬化作用的机理研究

摘要

1、研究背景及目的
　　动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)作为一种血管壁慢性炎症性疾病，具有慢性炎症的“共同点”，即炎症介质的持续释放和炎症消散的缺失。5-脂氧合酶(5-LO)代谢通路中的代谢产物白三烯B4(LTB4，促炎介质)和脂氧素A4(LXA4，促炎症消散介质)在As炎症中具有相反的生物学活性，内源性脂质介质LTB4和LXA4失衡促进了As的发生发展。因此，本课题在前期工作基础上，通过建立ApoE-/-小鼠As模型和体外RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症损伤模型，从抗炎和促炎症消散双方面调节的角度探讨参莲(SL)提取物的抗As作用。以促进As炎症消散为研究核心，重点观察了SL提取物对As炎症消散缺失中的巨噬细胞死亡、泡沫化、胞葬作用和相关受体表达的影响，系统地研究SL提取物促进As炎症消散的作用机理。并针对LTB4和LXA4合成途径中的关键酶、受体表达、生物学效应及下游信号通路等节点，探讨SL提取物在调节内源性炎症介质和促炎症消散介质再平衡的作用途径。
　　2、研究方法
　　2.1 SL提取物对ApoE-/-小鼠As形成的药效学研究
　　采用颈动脉套管法联合高脂喂养建立ApoE-/-小鼠As模型。ApoE-/-小鼠按体重随机分为5组，分别为模型对照组，SL提取物(95、190和380mg/kg/d)组和阿托伐他汀+吡格列酮(4.6mg/kg/d)组;C57BL/6J小鼠为正常对照组。通过高分辨率超声成像系统(UBM)观察小鼠套管侧颈动脉As斑块形成、主动脉弓壁厚、颈动脉和主动脉弓血流量的变化。结合颈动脉HE染色和血清中脂质代谢水平综合探讨SL提取物的抗As作用。
　　2.2 SL提取物对ApoE-/-小鼠As模型抗炎/促炎症消散平衡的影响
　　在“2.1”建立的ApoE-/-小鼠As模型基础上，从As炎症角度出发，通过ELISA观察小鼠血清中促炎介质MCP-1和促炎症消散介质IL-10、TGF-β1的变化;从5-LO代谢通路出发，通过ELISA观察小鼠血清中促炎代谢产物LTB4和促炎症消散代谢产物LXA4的变化，通过免疫荧光染色观察组织中LTB4受体BLT1的表达，系统地观察SL提取物对As形成过程中的促炎和炎症消散缺失两方面的作用。
　　2.3 SL提取物对小鼠巨噬细胞促炎症消散的影响
　　采用ox-LDL诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞建立炎症损伤模型。从As炎症消散的角度出发，通过MTT和油红O染色观察巨噬细胞存活率及泡沫细胞的形成;通过流式细胞术和活细胞工作站考察巨噬细胞对凋亡细胞的清除（胞葬作用）;通过免疫荧光观察巨噬细胞膜表面吞噬受体MerTK的表达。在此研究的基础上，通过ELISA和免疫荧光观察小鼠巨噬细胞5-LO代谢通路促炎症消散介质LXA4及其受体FPR1，合成途径中关键酶LTA4H和12-LO以及下游信号通路PKA的表达。系统评价SL提取物通过调节LXA4及其受体的内源性促炎症消散途径干预As炎症的作用机理。
　　2.4 SL提取物对小鼠巨噬细胞促炎介质的影响
　　采用4-HNE联合AA诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞建立炎症损伤模型。通过ELISA观察小鼠巨噬细胞5-LO代谢通路中促炎介质LTB4的表达。在此基础上，采用LTB4诱导RAW264.7巨噬细胞建立炎症损伤模型。通过免疫荧光染色观察小鼠巨噬细胞LTB4受体BLT1的表达，通过ELISA检测MCP-1含量，通过RT-PCR和免疫荧光染色观察小鼠巨噬细胞CD36的表达。系统评价SL提取物通过调节LTB4及其受体BLT1的内源性促炎途径干预As炎症的作用机理。
　　3、研究结果
　　3.1 SL提取物对ApoE-/-小鼠As形成的药效学研究
　　采用颈动脉套管法联合高脂喂养建立的ApoE-/-小鼠As模型较好的模拟了血管局部切应力变化、血流紊乱及脂质代谢异常导致As斑块形成过程，与人类As斑块的形成过程类似，模型构建成功。
　　研究结果显示:(1)模型对照组小鼠血清中TC、TG、LDL、ox-LDL水平以及AI显著升高，HDL水平显著降低。与模型对照组比较，SL提取物各剂量组小鼠血清中的TC、TG、LDL、ox-LDL水平和AI显著降低，SL提取物高剂量小鼠血清中HDL水平显著升高。(2) HE染色结果显示，模型对照组套管侧颈动脉近心端血管内膜和中膜结构被破坏，内膜明显增厚，中膜平滑肌细胞受压变薄，平滑肌细胞数量减少;管腔内发现斑块的形成，可见大量泡沫细胞的聚集，炎症细胞的浸润。SL提取物各剂量组的套管侧颈动脉近心端病理改变较模型对照组比较明显减轻。(3)高分辨率超声成像结果显示，与正常对照组比较，模型对照组主动脉弓的大弯区、小弯区和无名动脉区壁厚均显著增加;套管侧颈动脉血管管腔内As斑块多发，套管近心端，斑块几乎布满整个管腔，血管壁边界模糊;套管侧颈动脉近心端管腔面积显著减少;套管侧颈动脉近心端和远心端血流区域及流速均显著降低;主动脉弓和左侧颈动脉血流速度未见明显异常。与模型对照组比较，SL提取物各剂量组主动脉弓的大弯区、小弯区和无名动脉区壁厚均显著降低;套管侧颈动脉的远心端未发现斑块，在近心端的斑块也明显减少，血管壁边界逐渐清晰;套管侧颈动脉近心端的管腔面积明显增加，且呈剂量依赖性;SL提取物中剂量和高剂量组的近心端血流量显著升高，高剂量组的远心端血流量显著升高。
　　3.2 SL提取物对ApoE-/-小鼠As模型抗炎/促炎症消散平衡的影响
　　本实验构建ApoE-/-小鼠As模型的刺激因素均为As炎症反应的重要诱因，在此As模型的基础上，从As炎症角度考察SL提取物的作用。
　　研究结果显示:(1)模型对照组小鼠血清中的促炎介质LTB4和MCP-1含量均显著升高。与模型对照组比较，SL提取物各剂量组小鼠血清中LTB4水平显著降低，中剂量和高剂量组小鼠血清中MCP-1水平显著降低。(2)模型对照组小鼠斑块内和血管外膜BLT1受体的表达均显著上调，与模型对照组比较，SL提取物各剂量组斑块内和血管外膜BLT1受体的表达均显著下调。(3)模型对照组小鼠血清中的促炎症消散介质IL-10和LXA4含量均显著升高，TGF-β1含量显著降低。与模型对照组比较，SL提取物中剂量组和高剂量组IL-10水平在模型对照组基础上显著升高，高剂量组LXA4水平在模型对照组基础上亦显著升高，TGF-β水平与模型对照组比较无统计学差异。
　　3.3 SL提取物对小鼠巨噬细胞促炎症消散的影响
　　选用ox-LDL诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症损伤模型。研究结果显示:(1)25和50μg/ml ox-LDL诱导12h或24h，对细胞生长无影响。100μg/ml ox-LDL诱导12h或24h，对细胞的抑制率分别达到了29.7％和39.1％，而浓度达到200μg/ml时，对细胞的抑制率分别达到了65.6％和91.8％。SL提取物各浓度组对100μg/ml ox-LDL诱导细胞损伤有明显保护作用。(2)50μg/ml ox-LDL诱导12h或24h，镜下可见模型对照组细胞明显变大，伪足增加，且细胞中出现较大的“核”，油红O染色显示细胞内脂质着色明显，且随时间的延长，脂质沉积越明显。与模型对照组比较，SL提取物各浓度组巨噬细胞体积明显变小，且细胞中的“核”随浓度的增加也逐渐减小。油红O染色显示胞内脂质和平均光密度值显著降低。(3)流式细胞术(FACS)结果显示，紫外诱导的凋亡细胞主要集中在Q2区域中，细胞凋亡率为97.9％;激光共聚焦(LSCM)结果显示，巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬清除过程包括:发现凋亡细胞—伸出伪足—伪足包裹凋亡细胞—吞噬凋亡细胞—完全吞噬凋亡细胞，吞噬反应时间大约为3h; FACS结果显示，模型对照组的吞噬指数显著升高，SL提取物各浓度组的吞噬指数在模型对照组基础上亦显著升高。(4)ELISA结果显示，模型对照组细胞上清中的LXA4含量未见明显变化，而SL提取物低浓度和中浓度组细胞上清中的LXA4含量较模型对照组显著升高;免疫荧光染色结果显示，模型对照组显著上调细胞膜表面的FPR1受体，与模型对照组比较，SL提取物各浓度FPR1的表达在模型对照组基础上亦显著上调，且呈剂量依赖性。(5)免疫荧光染色结果显示，模型对照组胞质内LTA4H和12-LO表达均显著上调，与模型对照组比较，SL提取物各浓度组胞质内LTA4H表达显著降低;而对12-LO的表达较模型对照组无显著性差异。(6) ELISA检测结果显示，模型对照组细胞内PKA蛋白表达显著升高，与模型对照组比较，SL提取物各浓度组细胞内PKA含量在模型对照组基础上亦显著升高。
　　3.4 SL提取物对小鼠巨噬细胞促炎介质的影响
　　采用4-HNE和AA联合刺激RAW264.7细胞建立炎症损伤模型，研究结果显示:4-HNE和AA刺激后，细胞上清中的LTB4含量逐渐升高，在3h达到峰值，故选择3h作为4-HNE和AA联合刺激的最佳时间。在4-HNE联合AA诱导巨噬细胞3h的基础上，SL提取物各浓度组细胞上清中的LTB4含量显著降低，且呈剂量依赖性。
　　采用LTB4诱导RAW264.7细胞建立炎症损伤模型，研究结果显示:(1)ELISA结果显示，模型对照组细胞上清中的MCP-1含量显著升高，与模型对照组比较，SL提取物各浓度组细胞上清中的MCP-1含量显著降低，降低幅度到达5～6倍。(2)免疫荧光结果显示，模型对照组细胞膜表面BLT1受体显著上调，与模型对照组比较，SL提取物组BLT1受体表达显著下调。(3)RT-PCR和免疫荧光结果显示，模型对照组CD36 mRNA和细胞膜表面CD36蛋白均显著上调，与模型对照组比较，SL提取物组CD36 mRNA和细胞膜表面CD36蛋白均显著下调。
　　4、结论
　　终上所述，(1)SL提取物对右侧颈动脉套管法联合高脂喂养所建立的ApoE-/-小鼠As模型斑块的形成有明显地抑制作用，可减轻病变程度。(2) SL提取物对该ApoE-/-小鼠As模型炎症过程中的促炎介质和促炎症消散介质有明显地改善作用。(3)基于5-LO代谢通路，SL提取物可以调节内源性促炎介质LTB4和促炎症消散介质LXA4的再平衡而达到抑制As炎症的作用，其作用机制可能是通过调节二者的关键合成酶、受体表达、生物学效应以及下游信号通路而实现的。

目录

声明

摘要

英文缩略词

文献综述

综述一：炎症消散的缺失诱发As斑块形成的作用机制及中药复方干预As炎症新思路的探索

综述二：5-脂氧合酶代谢产物在As进程中的双重作用

前言

第一章 SL提取物对ApoE-／-小鼠As形成的药效学研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 SL提取物对ApoE-／-小鼠As模型抗炎／促炎症消散平衡的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 SL提取物对小鼠巨噬细胞促炎症消散的影响

第一节 SL提取物对小鼠巨噬细胞胞葬作用的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二节 SL提取物对小鼠巨噬细胞促炎症消散介质的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 SL提取物对小鼠巨噬细胞促炎介质的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

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致谢

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