解毒活血配伍对ApoE（-/-）小鼠AS易损斑块细胞凋亡相关基因表达的影响

摘要

目的：
　　观察基于中医“瘀毒”病机的解毒活血中药提取物配伍（山楂提取物配伍虎杖提取物）对载脂蛋白E基因敲除[ApoE（-/-）]小鼠血脂及动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)易损斑块的病理形态学影响，探讨解毒活血中药提取物配伍对ApoE（-/-）小鼠主动脉中细胞凋亡调控因子B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白（Bcl-2 Associated X protein，Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cellleukemia-2，Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(cysteinyl aspartatespecific proteinase，Caspase-9)的干预作用，为解毒活血中药配伍应用于临床防治AS提供实验数据。
　　方法：
　　选取8周龄雄性ApoE（-/-）小鼠64只，高脂膳食13周后，随机取4只，处死后取主动脉，证实易损斑块形成，其余小鼠随机分为模型组、辛伐他汀组、解毒活血配伍（山楂提取物+虎杖提取物）高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组12只。并以8周龄相同遗传背景的雄性C57BL/6J鼠12只，给予普通饲料，作为空白对照组。各组灌胃给药，每日一次，连续给药13周。模型组和空白对照组予以等体积蒸馏水灌胃，解毒活血配伍低、中、高剂量组分别按照:虎杖提取物40mg/kg+山楂提取物86.7mg/kg、虎杖提取物80mg/kg+山楂提取物173.4mg/kg、虎杖提取物160mg/kg+山楂提取物346.8mg/kg灌胃给药，其中山楂提取物含山楂总黄酮30％，虎杖提取物含虎杖苷98％。辛伐他汀组每日予辛伐他汀2.6mg/kg灌胃。给药期间除空白对照组予以普通饲料，其余各组均给予SPF级高脂饲料。给药结束后眼球取血测定小鼠血脂，HE染色观察小鼠主动脉病理形态的变化，RT-PCR法检测小鼠主动脉中凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-9的mRNA表达，免疫组化法检测小鼠主动脉易损斑块凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-9的蛋白表达。
　　结果：
　　血脂检测结果显示:与C57对照组比较，模型组血清总胆固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(lowdensity lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein，HDL)均有不同程度的升高，其中TC、LDL显著升高(P＜0.01);灌胃给药13周后，与模型组比较，各用药组血清TC、TG、LDL-C均有不同程度的降低，其中辛伐他汀组LDL-C显著降低（P＜0.05）;解毒活血高剂量组LDL-C、TC、TG均显著降低（P＜0.01或P＜0.05）;解毒活血中剂量组HDL-C显著升高（P＜0.05）;解毒活血低剂量组LDL-C显著降低（P＜0.05），HDL-C显著升高（P＜0.01）。各给药组之间相比，解毒活血高剂量组降低TG、LDL-C、TC的作用最为明显(P＜0.01或P＜0.05);各给药组升高HDL-C的作用无统计学差异（P＞0.05）。
　　ApoE（-/-）小鼠主动脉病理形态显示:C57对照组升主动脉壁薄且结构完整、规则、各层分界清楚，内膜表面未见泡沫细胞及斑块，中膜、外膜形态规则，内外弹力膜清晰可见，血管壁均匀，不增厚;模型组小鼠主动脉壁增厚，内膜可见大面积增厚、向管腔内隆起，内皮细胞有脱落，大片粥样斑块形成，斑块内可见大量泡沫细胞，中央可见大片粥样坏死区及钙化区，中膜平滑肌细胞增生、排列紊乱;灌胃给药13周后，各给药组光镜下病理改变类似模型组，但病变程度较模型组具有不同程度减轻，其中解毒活血高剂量组，粥样斑块面积明显减少，斑块内见多量泡沫细胞，未见钙化;解毒活血中剂量组，粥样斑块面积明显减少，斑块内见少量粥样坏死区及钙化区;解毒活血低剂量组，粥样斑块面积轻度减少，斑块内见中等量粥样坏死区及胆固醇结晶裂隙;辛伐他汀组，粥样斑块面积明显减少，斑块内见中等量粥样坏死区，泡沫细胞多见。
　　RT-PCR结果显示:与C57对照组比较，模型组主动脉Bax、Caspase-9 mRNA表达均显著升高(P＜0.01)，Bcl-2 mRNA表达降低无统计学意义（P＞0.05）;灌胃给药13周后，与模型组比较，辛伐他汀组和解毒活血高剂量组均能降低主动脉Bax mRNA表达（P＜0.01或P＜0.05），且辛伐他汀组降低最显著;解毒活血高剂量组及辛伐他汀组主动脉CAS-9 mRNA表达均显著降低(P＜0.01或P＜0.05);解毒活血高、中剂量组显著升高Bcl-2 mRNA表达水平（P＜0.05）。
　　免疫组化结果显示:与C57对照组比较，模型组主动脉易损斑块内Bax、Caspase-9蛋白表达均显著升高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白显著降低（P＜0.05）;灌胃给药13周后，与模型组比较，解毒活血高、中剂量组及辛伐他汀组主动脉易损斑块Bax蛋白表达均显著降低（P＜0.01或P＜0.05）;解毒活血中剂量组、辛伐他汀组主动脉易损斑块Caspase-9蛋白表达均显著降低(P＜0.01);辛伐他汀组、解毒活血高、中剂量组主动脉易损斑块Bcl-2蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01或P＜0.05）。各给药组之间比较，解毒活血高剂量组Bax表达显著降低，差异具有显著性（P＜0.01）;解毒活血高剂量组Bcl-2蛋白表达升高最显著(P＜0.01)。
　　结论：
　　解毒活血中药提取物配伍能明显改善ApoE（-/-）小鼠的血脂水平，保护血管内皮，减轻AS病变，其可能的机制为通过下调促凋亡因子Bax、Caspase-9表达，上调抗凋亡因子Bcl-2表达抑制血管细胞凋亡，从而延缓AS进展。

目录

声明

摘要

英文缩略语

文献综述

综述一 细胞凋亡因子Bax、Bcl-2、Caspase-9与动脉粥样硬化的关系及中西药干预研究进展

参考文献

综述二 中医药干预ApoE(-／-)小鼠动脉粥样硬化研究进展

参考文献

实验研究 解毒活血中药提取物配伍对ApoE(-／-)小鼠AS易损斑块细胞凋亡相关基因表达的影响

前言

1 材料及方法

1．1 实验动物

1．2 实验药物

1．3 仪器及试剂

1．4 动物分组及给药

1．5 取材和标本制备

1．6 主动脉HE染色

1．7 RT-PCR动脉Bax、Bcl-2、Caspase-9的检测

1．8 免疫组化法主动脉Bax、Bcl-2、Caspase-9蛋白检测

1．9 统计分析

2 结果

2．1 解毒活血配伍对ApoE(-／-)小鼠血脂的影响

2．2 解毒活血配伍对ApoE(-／-)小鼠主动脉内皮的影响

2．3 解毒活血配伍对ApoE(-／-)小鼠Bax、Bcl-2、Caspase-9 mRNA表达的影响

2．4 解毒活血配伍对ApoE(-／-)小鼠主动脉易损斑块内Bax、Bcl-2、Caspase-9蛋白表达的影响

3 讨论

3．1 解毒活血配伍对ApoE(-／-)小鼠血脂的影响

3．2 解毒活血配伍对ApoE(-／-)小鼠主动脉内皮的影响

3．3 解毒活血配伍对ApoE(-／-)小鼠Bax、Bcl-2、Caspase-9表达的影响

4 小结

参考文献

致谢

个人简历