健脾祛湿和络方调控肾小球足细胞及系膜细胞的分子机制研究

摘要

第一章:文献综述
　　健脾祛湿和络方常用于缓解肾病的蛋白尿及血尿，具有减轻肾损害,保护肾功能的作用。目前关于肾脏的生理病理研究表明，足细胞作为高度分化的终末期细胞，较易受到致病刺激的影响，受损后影响了肾小球滤过屏障的完整，进而导致蛋白尿的产生;此外，GMCs受到致病刺激后，会过度增殖并表达大量ECM，导致肾小球内系膜区膨胀，挤压毛细血管袢影响肾小球正常结构，进而引发血尿和蛋白尿。近年相关实验研究表明，多种中草药或中药复方对减轻足细胞、系膜细胞损伤，缓解肾脏疾病具有显著作用。故本研究旨在通过探索健脾祛湿和络方对肾小球内足细胞及GMCs的作用，构建该方临床疗效的实验基础。
　　第二章:健脾祛湿和络方对损伤足细胞作用机制研究
　　研究目的:通过氨基核苷嘌呤霉素(PAN)诱导体外足细胞损伤。探索健脾祛湿和络方含药血清对损伤模型的相关标志蛋白及mTOR相关自噬因子表达的影响。探索健脾祛湿和络方对损伤足细胞的作用机制。
　　研究方法:(1)健脾祛湿和络方及替米沙坦、RAP、激素大鼠灌胃提取含药血清。(2)用10％FBS+DMEM配成的培养基于细胞箱内培养足细胞。(3)使用氨基核苷嘌呤霉素(PAN)诱导足细胞损伤模型。(4)检测各组含药血清对正常足细胞的毒性后，将含药血清作用于足细胞损伤模型，采用CCK-8法，酶标仪检测各组OD值，检测损伤模型在各组血清作用后的活性变化。(5) western blot法检测健脾祛湿和络方作用于足细胞模型后，细胞标志蛋白nephrin、podocalyxin及细胞内mTOR相关自噬蛋白表达的水平，以判断健脾祛湿和络方对损伤模型的作用。
　　研究结果:(1)健脾祛湿和络方及对照组的血清对足细胞无毒副作用;(2)嘌呤氨基核苷(PAN)对足细胞具有损伤作用，100μg/mlPAN作用下，足细胞损伤为正常组50％左右，为较为理想的造模药物浓度;(3)健脾祛湿和络方含药血清作用于损伤足细胞后，低、中含药血清组与正常组间差别无统计学意义(P＞0.05)，高剂量健脾祛湿和络方含药血清较模型组相比，可减轻足细胞的损伤(P＜0.05)，高含药血清组与西药对照组间差别无统计学意义(P＞0.05);(4)健脾祛湿和络方组成药物防己的提取物——汉防己甲素，其药量在6.25μg/ml以下对足细胞无毒性作用，6.25μg/ml以上对足细胞损伤作用明显(P＜0.05);(5)健脾祛湿和络方可改善损伤足细胞模型的细胞活性，促进足细胞标志蛋白nephrin、podocalyxin的表达，且安全无毒性;(6) PAN诱导的损伤足细胞模型内mTOR自噬相关因子明显激活，其下游蛋白P-P70S6K、P-4EBP1等合成显著增多，同时，损伤模型内与自噬水平呈正相关的LC3-Ⅱ含量明显减少。表明PAN诱导的损伤模型内mTOR活性增强且正常的自噬程度降低。健脾祛湿和络方高剂量组含药血清可明显上调细胞模型内LC3-Ⅱ表达，减少mTOR及其相关因子的合成，改善细胞内降低的自噬水平。且健脾祛湿和络方高剂量组与西药对照组间的差别不具有统计学意义。(p＞0.05)。
　　研究结论:健脾祛湿和络方对PAN诱导的损伤足细胞有修复作用。
　　第三章:健脾祛湿和络方对增殖GMCs作用研究
　　研究目的:研究健脾祛湿和络方对脂多糖(LPS)介导的体外GMCs增殖模型分泌层粘连蛋白、纤维连接蛋白及生长因子TGF-β1的影响。探讨健脾祛湿和络方临床可治疗慢性肾炎的细胞作用机制。
　　研究方法:健脾祛湿和络方及对照组药物给实验大鼠灌胃后制备各组含药血清。用10％FBS+DMEM配制培养基于体外培养脂多糖(LPS)介导的增殖GMCs模型。采用酶联免疫法吸附试验(ELISA)测定含药血清作用于增殖的GMCs后，GMCs上清液中细胞外基质主要组成物质(LN、FN、TGF-β1)含量。
　　研究结果:(1) LPS可诱导增殖GMCs大量分泌ECM组成成分，且作用时间越长，分泌越多;(2)健脾祛湿和络方中高剂量含药血清在24h、48h、72h对LPS诱导的增殖GMCs细胞上清液中LN、FN、TGF-β1表达均有抑制作用，差值具有统计学意义(P＜0.05)。且随健脾祛湿和络方药物浓度的升高及作用时间的增加，GMCs分泌量越少。健脾祛湿和络方低药量组与正常组间差值不具有统计学意义(P＞0.05)。
　　研究结论:健脾祛湿和络方能显著抑制病理状态下LPS诱导的增殖GMCs过度分泌层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)、转化生长因子(TGF-β1)。这可能是健脾祛湿和络方治疗慢性肾炎血尿和蛋白尿，预防肾脏纤维化的作用机制。
　　第四章:问题与展望。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一章 文献综述

1．1 中医对慢性肾炎的认识

1．1．1 中医病名

1．1．2 病因病机

1．1．3 中医对蛋白尿的认识

1．1．4 中医对血尿的认识

1．1．5 中医治疗选方用药

1．1．6 中药治疗慢性肾炎的相关实验研究

1．1．7 健脾祛湿和络方治疗慢性肾炎解析

1．2 现代医学对慢性肾炎蛋白尿及血尿产生机制的认识

1．2．1 现代医学对蛋白尿产生机制的探索

1．2．2 现代医学对血尿产生机制的探索

参考文献

第二章 健脾祛湿和络方对损伤足细胞的作用机制研究

前言

2．1 含药血清对PAN诱导的损伤足细胞模型的作用

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法及步骤

2．1．3 实验结果

2．2 健脾祛湿和络方对足细胞模型标志蛋白及mTOR相关自噬因子的影响

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法及步骤

2．2．3 实验结果

2．3 讨论

2．3．1 嘌呤霉素氨基核苷建立的足细胞模型

2．3．2 健脾祛湿和络方对损伤足细胞活性的影响

2．3．3 粉防己提取物汉防己甲素(TET)的安全性

2．3．4 雷帕霉素的作用

第三章 健脾祛湿和络方对增殖系膜细胞的作用机制研究

前言

3．1 健脾祛湿和络方对脂多糖(LPS)诱导的系膜细胞模型的作用

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法及步骤

3．2 实验结果

3．2．1 各组血清对LPS诱导的增殖GMCs上清液FN的作用

3．2．2 各组血清对LPS诱导的增殖GMCs上清液LN的作用

3．2．3 各组血清对LPS诱导的增殖GMCs上清液TGF-β1的作用

3．3 讨论

3．3．1 LPS诱导系膜细胞增殖过度分泌ECM

3．3．2 健脾祛湿和络方组方对ECM沉积的抑制作用

第四章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

致谢

个人简历