益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响及机理研究

摘要

目的:
　　通过建立可复制的、稳定的持续性高眼压动物模型，观察益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响，并对其作用机理进行初步的探讨，为该中药的临床应用提供科学依据。
　　方法:
　　1.SD大鼠高眼压模型建立研究:采用烧灼巩膜上静脉法，建立慢性高眼压模型，将高眼压大鼠分别于造模后7天、14天、21天、28天各处死10只。空白对照组10只，未做特殊处理。分别通过眼压测量观察大鼠的眼压变化，HE染色观察造模后7天、14天、21天、28天及空白组大鼠视网膜组织病理改变，Tunel检测造模后7天、14天、21天、28天及空白组大鼠RGCs细胞凋亡情况。
　　2.益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠RGCs凋亡的作用机理研究:选用健康雄性的SD大鼠60只，随机分为5组，空白组、模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组，每组各12只。除空白组，其余4组采用烧灼巩膜上静脉法，建立慢性高眼压模型。干预1个月后，分别采用眼压测量观察各组大鼠的眼压变化，HE染色观察各组大鼠视网膜的病理学改变，Tunel法检测各组大鼠RGCs凋亡情况，免疫组化染色法检测各组大鼠RCRs层Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达，RT-PCR法检测各组大鼠视网膜中Bcl-2mRNA、BaxmRNA、Caspase-3mRNA的相对表达量。
　　结果:
　　1.SD大鼠高眼压模型建立研究:(1)眼压测量:造模后即刻，模型组大鼠眼压较造模前、空白对照组显著性增高(P＜0.01)。造模后7天、14天、21天、28天大鼠眼压较造模前、空白对照组显著性增高(P＜0.01)，较造模后即刻无显著性差异(P＞0.05)，各时间点眼压比较无显著性差异(P＞0.05)。(2) HE染色后光学显微镜下观察，与空白组不同，模型组随着高眼压时间的延长，视网膜破坏越来越严重，视网膜结构不完整，RGCs层排列紊乱、形态不规则，细胞胞核裂解、变性等，内、外核层排列疏松。通过计数RGCs层细胞数量发现，造模后7天、14天、21天、28天大鼠RGCs层细胞数量较空白对照组显著减少(P＜0.01)，并且随着造模时间的延长，各时间点RGCs层细胞数量不断递减，有统计学意义(P＜0.01)。(3) Tunel检测示，造模后7天、14天、21天、28天大鼠RGCs中凋亡率较空白对照组显著升高(P＜0.01)，并随造模时间的延长，各时间点RGCs凋亡率呈递增趋势，有统计学意义(P＜0.01)。
　　2.益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠RGCs凋亡的作用机理研究:(1)眼压测量:各组大鼠造模前眼压比较无显著性差异(P＞0.05)。造模后用药前，模型组及各用药组大鼠眼压与造模前、空白组比较有显著性差异(P＜0.01)，模型组与各用药组比较无显著性差异(P＞0.05)。用药后1个月，模型组及各用药组与造模前、空白组比较有显著性差异(P＜0.01)，与造模后用药前比较无统计学意义(P＞0.05)，但各用药组眼压有所下降。各用药组间比较无显著性差异(P＞0.05)，与模型组比较无统计学意义(P＞0.05)。(2) HE染色显示，与空白组不同，模型组大鼠视网膜结构不完整，RGCs排列十分紊乱、形态不规则，部分细胞胞核裂解、变性，内、外核层疏松;中药中剂量组大鼠视网膜各层次基本分明，RGCs排列较整齐，形态较规则;中药中剂量组优于高、低剂量组。通过计数RGCs层细胞数量发现，模型组RGCs层细胞数量较正常组显著减少(P＜0.01);中药高、中剂量组细胞数量高于模型组(P＜0.01);低剂量组较模型组无统计学意义(P＞0.05)。(3) Tunel检测显示，模型组可见较多RGCs层细胞凋亡，内、外核层存在细胞凋亡，各治疗组RGCs层细胞凋亡较模型组减少，其中中剂量组细胞凋亡最少。空白组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，中药中剂量组凋亡率较模型组有显著性差异(P＜0.01)，中药高、低剂量组凋亡率较模型组差异无统计学意义(P＞0.05)。(4)免疫组化染色法检测，模型组大鼠RCRs中Bcl-2略有表达，Bax、Caspase-3明显表达;中药中剂量组大鼠RCRs中Bcl-2明显表达，Bax、Caspase-3略有表达;中药中剂量组优于高、低剂量组。中药治疗组、模型组较正常组均有显著性差异(P＜0.01);与模型组相比，中药中剂量组的Bcl-2表达显著增多(P＜0.01)，Bax、Caspase-3的表达显著减少(P＜0.01);高、低剂量组Bcl-2、Bax、Caspase-3表达较模型组无统计学意义(P＞0.05)。(5) RT-PCR检测显示，中药中、低剂量组的Bcl-2mRNA相对表达量较模型组显著增多(P＜0.01)，高剂量组较模型组无统计学意义(P＞0.05);中药中剂量组BaxmRNA相对表达量较模型组显著减少(P＜0.01)，低剂量组有一定的减少(P＜0.05)，高剂量组较模型组无统计学意义(P＞0.05);中药中剂量组的Caspase-3mRNA相对表达量较模型组显著减少(P＜0.01)，高、低剂量组较模型组无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论:
　　1.通过烧灼巩膜上静脉法，建立稳定的高眼压动物模型，造模后大鼠眼压明显升高，并随高眼压持续时间延长，视网膜损伤表现越典型。
　　2.益精杞菊地黄颗粒剂对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞的凋亡有明显的保护作用。
　　3.益精杞菊地黄颗粒剂抑制RGCs凋亡的作用机理可能与Bcl-2蛋白的表达上调，Bax和Caspase-3蛋白的表达下调有关。

目录

声明

摘要

中英文缩略语对照表

综述 中西医治疗对青光眼视神经保护的研究进展

参考文献

前言

第一部分 SD大鼠慢性持续性高眼压模型的建立

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 实验方法

2．1 实验分组

2．2 高眼压动物模型的建立

2．3 取材及标本制备

3 检测方法

3．2 HE染色

3．3 TUNEL细胞凋亡检测

4 统计学分析

5 结果

5．1 眼压测量结果

5．2 HE染色观察大鼠视网膜的病理变化

5．3 Tunel检测大鼠RGCs细胞凋亡

6．小结

第二部分 益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响及机理研究

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验药物

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

2 实验方法

2．1 实验分组及给药

2．2 高眼压动物模型的建立

3．4 免疫组织化学染色

3．5 Real Time-PCR检测

4 统计学分析

5．1 眼压测量结果

5．2 HE染色观察各组大鼠视网膜的病理变化

5．3 Tunel检测各组大鼠RGCs凋亡结果

5．4 免疫组化染色法检测各组大鼠RCRs中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达

5．5 RT-PCR法检测各组大鼠视网膜组织中Bcl-2mRNA、BaxmRNA、Caspase-3mRNA的相对表达量

6．小结

附图

讨论

1．青光眼病因病机探讨

1．1 脏腑气血失调致病

1．2 情志致病

1．3 其他不良因素影响

2．动物模型的制备与思考

3．Bcl-2、Bax和Caspase-3在视网膜神经节细胞凋亡中的作用

4．益精杞菊地黄颗粒的立方依据

5．探讨益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠RGCs的作用机制

6．展望

结论

参考文献

致谢

个人简历