补气药黄芪、人参及其配伍免疫调节和代谢组学研究

摘要

黄芪、人参为临床最广为使用的补气药，用于治疗各种气虚之症。可以用于改善亚健康人群出现的精神萎靡，疲倦乏力等免疫低下的状态，还可以用于治疗因重大疾病（如恶性肿瘤病）导致免疫力急剧下降。临床上关于黄芪、人参的补气内涵模糊，其补气的具体作用机制尚未见有深入探讨。本论文围绕解释黄芪、人参补气内涵，以正常和免疫抑制两个动物模型为研究对象，借助免疫学技术以及代谢组学技术，在器官、细胞和分子水平上，关联分析免疫药效学指标变化趋势与代谢组学体内小分子轮廓扰动情况，同时借助系统药理学方法，来探讨黄芪、人参的免疫学差异及其调节机理，对二药的补气内涵进行初步探索。
　　一、黄芪、人参的质量控制
　　依据2015版《中国药典》对实验所用的黄芪、人参的质量进行评估。使用高效液相-蒸发光检测法对黄芪药材中的黄芪甲苷，人参药材中的人参皂苷Rg1，人参皂苷Re和人参皂苷Rb1进行含量测定;使用高效液相-紫外检测法对毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行含量测定，结果显示黄芪甲苷含量为0.128％，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为0.0315％，人参皂苷Rb1，人参皂苷Re和人参皂苷Rg1的含量分别为:0.683％，0.412％和0.213％，符合药典标准。
　　二、正常动物模型的免疫调节及代谢组学研究
　　为探讨补气药黄芪、人参的补气差异，本研究运用免疫学和血浆代谢组学方法综合分析黄芪、人参对于正常模型小鼠的影响。
　　通过给予小鼠黄芪（低、中、高剂量）、人参（低、中、高剂量），黄芪∶人参=1∶1（低、中、高剂量），黄芪∶人参=4∶1（低、中、高剂量），黄芪∶人参=8∶1（低、中、高剂量）灌胃30天。脏器指数实验表明，黄芪、人参及其配伍均可以增强小鼠脾脏指数。但是，仅配伍后可见小鼠胸腺指数得增强。细胞实验提示，与空白组比较，黄芪、人参均能提高脾脏淋巴细胞增殖转化率，但是黄芪组与人参组二者相比较，无显著性差异。配伍使用后，8∶1组效果最佳;同时，对于NK细胞杀伤活性，黄芪、人参则出现促进作用。由此可知，黄芪、人参都可以通过增强机体脏器指数，非特异性免疫（NK细胞杀伤活性）和特异性免疫（淋巴细胞增殖活性）来提高机体免疫力。
　　基于HPLC-ESI-Q-TOF-MS系统，建立黄芪、人参及其配伍对于正常小鼠的血浆代谢组学研究方法，将原始数据通过cef转换，导入MPP软件进行数据差异统计分析，选取空白对照组(BCG)为比较对象，对数据进行频次分析，非配对t检验分析以及方差分析，p值小于0.05和fold change大于2的被选取为差异代谢物。同时使用SIMCA-P14.1软件，对数据进行无监督主成分分析(PCA)和有监督的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。将所得差异化合物通过数据库进行二级碎片结构确认，得到最终生物标记物。结合免疫学指标，通过MetPA数据库构建黄芪、人参免疫相关代谢通路。通过关联性分析，得出与四大免疫指标强关联性生物标记物，分别是:黄芪组:Uracil，LysoPC(18∶3(6Z，9Z，12Z))，Sphinganine;人参组:LPA(0∶0/16∶0)，UDP-glucuronate，PC(14∶0/18∶0)，LPA(0∶0/16∶0);1∶1组:Uracil,Dihydroceramide;4∶1组:Uracil,L-Tyrosine;8∶1组:Uracil，Kynurenine。提示黄芪、人参补气内涵有相同点，都与甘油磷脂代谢相关。同时又有侧重点，黄芪偏向于调控嘧啶代谢和鞘脂代谢，人参偏向于调控糖代谢。
　　三、免疫抑制动物模型的免疫调节及代谢组研究
　　为进一步探讨补气药黄芪、人参的补气内涵，本研究运用免疫学，血液学，血浆代谢组学和骨髓代谢组学方法分析黄芪、人参及其配伍对于免疫抑制小鼠的影响。第1到9天，每天给药1次;第4到6天，每天腹腔注射环磷酰胺一次，复制免疫抑制模型，期间第1、4、7、9天分别取血进行血常规检测。本次试验给药特点，通过预防性给药来模拟临床化疗治疗情况。
　　血细胞实验提示，环磷酰胺能够有效降低血液中的白细胞、红细胞，血红蛋白以及血小板的水平。通过给予黄芪、人参之后，与模型组比较，黄芪组，人参组，1∶8组，1∶1组以及8∶1组均见白细胞，红细胞，血红蛋白以及血小板水平显著性回升，但是黄芪和人参相比，无显著性差异。由可知黄芪、人参可以通过改善三系细胞来提升机体免疫力，配伍效果增强（8∶1组）。但是无法区分黄芪、人参对于血液细胞的影响。
　　免疫学实验提示，在脏器指数影响水平上，黄芪、人参及其配伍对可以增强小鼠的脾脏指数和胸腺指数。同时发现，配伍效果强于单用，8∶1组效果最佳。在免疫细胞影响水平上，黄芪、人参均能提高机体特异性免疫（增强脾脏淋巴细胞增殖转化率）。配伍使用后，8∶1效果最佳;黄芪、人参均能提高机体非特异性免疫（增加NK细胞杀伤活性）。配伍使用后，8∶1组效果最佳。由此可知，黄芪与人参均能通过提升免疫低下小鼠的脏器指数，特异性免疫以及非特异性免疫来提高机体免疫力，配伍后的8∶1组疗效显著。
　　基于HPLC-ESI-Q-TOF-MS系统，建立黄芪、人参及其配伍对于免疫抑制小鼠的血浆与骨髓代谢组学研究方法，从分子层面探讨补气药对于气虚小鼠的补气机理。
　　血浆代谢组学研究发现，黄芪组偏于通过11-顺式视黄醇（11-cis Retinol）调控视黄醇代谢（Retinol metabolism）。人参组免疫关联性生物标志物代谢通路为柠檬酸（Citric acid）参与二羧酸代谢（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）和三羧酸循环(Citrate cycle)，高香草醛(Homovanillin)参与酪氨酸代谢(Tyrosine metabolism)。同时，8∶1组下的与免疫相关的代谢通路主要是:1.精氨酸和脯氨酸代谢;2.甘油酯代谢;3.甘油磷脂代谢。由此可知道，黄芪参与调控机体内环境通路作用范围不及人参，人参侧重于三羧酸循环。当配伍后，8∶1组进一步参与调控体内多个氨基酸代谢通路，同时脂质代谢（甘油磷脂代谢与甘油酯代谢）也参与调控免疫系统，进而综合提升机体免疫力。
　　骨髓代谢组学研究发现，在黄芪组中，黄芪低剂量组PCA轮廓分析图相比于其他给药组，更接近于空白组，提示黄芪低剂量有着改善骨髓内环境的作用。同时在比较黄芪中剂量组，人参高剂量组，1∶8组，1∶1组以及8∶1组时发现，人参高剂量离空白组最远，配伍后的1∶8组与8∶1组较其他给药组，更趋向于空白对照组，表明配伍有助于免疫抑制小鼠内环境趋向于正常。同时通过相关性分析可知，黄芪组参与甘油磷脂代谢，人参组参与调控代谢通路为酪氨酸代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。配伍后，1∶8组，1∶1组和8∶1组主要参与调控代谢通路为鞘脂代谢和甘油磷脂代谢。
　　四、系统药理学研究
　　系统药理学研究发现，黄芪、人参分别总得到87与190个化学成分，这些化学成分通过ADME筛选(OB＞30％，DL＞0.18)及文献筛选过后，分别得到37个和72个潜在活性分子。通过WES模型对这些活性分子进行打靶研究，共分别得到152与156个作用靶点。利用这些靶点基因，通过KEGG数据库构建代谢通路，将代谢组学所得出的通路一一映射到基因构建的通路上。结果发现，黄芪组中乙酰胆碱酯酶，鞘氨醇激酶1，β-半乳糖苷酶，胞核嘧啶核苷脱氨酶这四个酶影响着重要的免疫相关的甘油磷脂代谢，鞘脂代谢以及嘧啶代谢。人参组中醛糖还原酶，糖原磷酸化酶，葡萄糖醛酸转移酶，胆碱乙酰转移酶，乙酰胆碱酯酶和溶酶体α-葡糖苷酶同时也调控着甘油酯代谢，甘油磷脂代谢以及糖代谢（淀粉与蔗糖代谢和戊糖、葡萄糖转化）。
　　综上所述，黄芪、人参均可以通过不同方式起到调节免疫的作用。正常动物模型下的药效指标无法区分黄芪、人参的免疫调节的差异。通过代谢组学研究则发现，黄芪、人参补气具有异同点。黄芪和人参补气共同点为脂代谢，黄芪侧重于调控嘧啶代谢和鞘脂代谢，人参侧重于调控糖代谢。免疫抑制模型下的药效研究来看，黄芪、人参均可以通过改善血液指标以及免疫学（特异性与非特异性免疫）来提高免疫抑制小鼠的免疫能力，且配伍作用最优。结合分析血浆代谢组学和骨髓代谢组学数据，发现黄芪的免疫调节内涵可能与视黄醇代谢和甘油磷脂代谢有关，而人参则主要是调控氨基酸代谢（精氨酸与脯氨酸代谢），二羧酸代谢，三羧酸循环，进而调控免疫系统。配伍使用后，配伍内涵体现在，代谢通路向鞘脂代谢与甘油磷脂代谢偏移。骨髓代谢情况则相对于血浆来说，保守一些。骨髓内环境中，黄芪组主要调控的是甘油酯代谢，人参组主要调控的是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和酪氨酸代谢。配伍之后，代谢情况向鞘脂代谢与甘油磷脂代谢偏移。同时发现，乙酰胆碱酯酶，鞘氨醇激酶1，β-半乳糖苷酶，胞核嘧啶核苷脱氨酶以及醛糖还原酶，糖原磷酸化酶，葡萄糖醛酸转移酶，胆碱乙酰转移酶，乙酰胆碱酯酶和溶酶体α-葡糖苷酶可能是免疫调节的作用靶点。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

第一节中医元气、卫气理论

第二节中医学“气”与现代医学免疫的关系

第三节古代关于黄芪、人参补气的认识

第四节黄芪、人参与免疫病理相关性研究

第五节代谢组学研究进展

第六节系统药理学研究进展

第二章前言

第一节课题立项依据

第二节研究内容

第三节技术路线图

第三章黄芪、人参质量控制

第一节仪器与试药

第二节方法与结果

第三节小结

第三章黄芪、人参对于正常动物的影响

第一节黄芪、人参及其配伍对正常小鼠免疫功能的影响

1实验材料

2动物分组与给药

3实验方法

4实验结果

5小结

第二节黄芪、人参及其配伍对正常小鼠血浆代谢组学的影响

1实验材料

2动物分组及给药

3实验方法

4结果

第四章黄芪、人参对于疾病动物的影响

第一节黄芪、人参及其配伍对免疫抑制模型小鼠血细胞及免疫功能的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4小结

第二节黄芪、人参及其配伍对免疫抑制小鼠血浆代谢组学的影响

1实验材料

2动物分组及给药

3实验方法

4结果

5总结

第三节黄芪、人参及其配伍对免疫抑制小鼠骨髓代谢组学的影响

1实验材料

2动物分组及给药

3实验方法

4结果

5总结

第五章黄芪、人参作用靶标研究

第一节研究方法

第二节结果与讨论

结论

参考文献

创新点

致谢

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