含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对大鼠出血性脑损伤的保护作用及机理研究

摘要

本论文研究的主要内容包括两部分：第一部分采用大鼠脑出血损伤动物模型，从整体水平观察含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对大鼠脑出血损伤的保护作用并探讨其机制；第二部分从细胞水平观察含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清和含药脑脊液对原代皮层神经元的保护作用并探讨其机制。 第一部分:含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对大鼠脑出血损伤的保护作用及机制研究 建立胶原酶诱导大鼠脑出血损伤动物模型，观察安宫牛黄丸对大鼠脑出血损伤的保护作用，并探讨其可能机制，同时以不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸与之对比，观察去掉朱砂雄黄之后作用与全方是否存在差别。 1.含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对脑出血大鼠保护作用的研究 目的：研究安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠神经症状、脑系数、脑含水量、全血的血液流变性、抗氧化能力、病理形态学的影响。同时观察不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸与之是否存在差异。方法：采用尾状核注射胶原酶(TYPEⅣ)脑出血模型大鼠，于术后第3天进行神经病学症状评分；称重法测定脑系数；干湿重法测定脑含水量；生化试剂盒检测脑组织匀浆中LDH、SOD活性，MDA含量；血流变仪进行血液流变学检测；HE染色进行病理形态学观察。 结论： (1) 安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠有保护作用a可显著改善神经症状、降低脑指数、提高红细胞变形性，降低LDH活性、提高SOD活性、降低MDA含量，改善组织病理形态。 (2) 去朱砂、雄黄后改善神经症状作用有所减弱，两个剂量组与模型组相比均无显著性差异。降低脑指数、提高脑组织SOD活性，减少LDH含量和：提高红细胞变形性指标上作用有所减弱，小剂量组与模型组相比无显著性差异。全方等效剂量对这些指标有显著改善作用,但两种药物等效剂量组间比较无显著性差异。 2 .含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠脑组织凋亡相关蛋白、血脑屏障通透性相关蛋白的影响 目的：探讨安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠细胞凋亡、凋亡相关蛋白表达、以及血脑屏障通透性相关蛋白表达的影响。同时观察不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对这些蛋白表达的影响与之是否存在差异。方法：用免疫组化的方法观察脑出血模型大鼠出血侧细胞的凋亡(TUNEL染色)、凋亡相关蛋白的表达(Bcl-2，Bax)、血脑屏障通透性相关蛋白．(MMP9、AQP4)的表达。 结论： (1)安宫牛黄丸可以通过抗凋亡、影响血脑屏障通透性来发挥神经保护作用。 (2)不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对血脑屏障通透性相关蛋白表达的影响与全方相近，对凋亡的抑制作用有所减弱，两个剂量组TUNEL染色阳性表达与模型组相比均无显著性差异。两个剂量组促进Bcl-2表达的作用均不显著。全方和简方等效剂量组间比较无显著性差异。 3. 含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠脑组织MAPK通路的影响 目的：探讨安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠脑组织MAPK通路的影响，同时观察不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠MAPK通路的影响与之是否存在差异。方法：应用免疫组化的方法观察脑出血大鼠脑组织与MAPK通路活化相关蛋白-PKC、MAPK通路底物蛋白c-fos、c-jun的表达，用实时荧光定量RT-PCR的方法观察MAPK通路家族ERKmRNA、P38mRNA的表达，比较不含朱砂、雄黄的安富牛黄丸对其表达的影响与安宫牛黄丸是否存在差异。 结论： (1) 安宫牛黄丸可以通过影响MAPKK通路发挥神经保护作用。 (2) 不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸也可以通过影响MAPK通路发挥神经保护作用。其中减少c-fos、c-jun、P38mRNA的表达的作用明显弱于安宫牛黄丸组，在这些指标上，两种药物相应剂量之间进行组间比较，差异有统计学意义。朱砂雄黄与安宫牛黄丸对MAPK通路的调节作用可能有关。 第二部分:含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对原代培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用及机理的研究(血清、脑脊液药理) 建立缺糖缺氧诱导损伤、谷氨酸诱导损伤原代培养皮层神经细胞模型，观察含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对两种损伤细胞的保护作用，及对损伤细胞线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度的影响。同时进行脑脊液、血清中砷、汞含量测定，探讨神经元保护与血清、脑脊液中砷、汞的关系。 4 .含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对体外培养的原代皮层神经元的保护作用 目的：观察含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对损伤神经细胞的保护作用是否存在差异，明确朱砂雄黄在全方中的作用。方法：采用缺糖缺氧诱导损伤细胞模型和谷氨酸诱导损伤细胞模型，用血清药理学和脑脊液药理学的方法观察含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对损伤神经元的保护作用。 结论： (1)安宫牛黄丸大剂量组含药血清、含药脑脊液可对抗缺糖缺氧损伤引起的细胞活性降低，两个剂量组含药血清含药脑脊液均可降低LDH漏出率。不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液降低缺糖缺氧LDH漏出率作用有所减弱，小剂量含药血清含药脑脊液不能显著降低LDH漏出率。两种药物相应剂量含药血清、含药脑脊液组间比较无统计学意义。 (2)安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对谷氨酸诱导的神经元损伤有对抗作用。提高损伤细胞活性、降低损伤细胞LDH漏出率、降低MDA含量、提高SOD活性是其对抗谷氨酸诱导损伤的可能机制。不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液提高损伤细胞活性、降低损伤细胞LDH漏出率、降低MDA含量的作用均有所减弱。两个剂量的含药脑脊液对损伤引起的细胞活性降低均无明显对抗作用，与模型组相比无统计学意义。小剂量含药血清、大剂量10％添加比例的脑脊液不能显著降低损伤细胞LDH漏出率，大剂量10％添加比例的脑脊液不能显著降低损伤细胞MDA含量，全方相应剂量的血清或脑脊液在相应指标上有显著改善作用。但两种药物相应剂量含药血清、含药脑脊液组间并无明显差异。 5. 含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对谷氨酸损伤神经元线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度的影响 目的：观察安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对损伤神经细胞的线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度的影响。同时观察不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液的作用，与之进行比较。方法：采用谷氨酸诱导损伤细胞模型，应用流式细胞技术测定线粒体膜电位和细胞内钙离子浓度，进行组间比较。 结论：安宫牛黄丸可以升高损伤细胞的线粒体膜电位，降低损伤细胞内钙离子浓度；不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对损伤引起的膜电位降低有明显改善，不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药脑脊液对细胞内钙超载的对抗作用较全方含药脑脊液明显减弱，朱砂雄黄可能与安宫牛黄丸抑制钙超载作用有关。 6. 含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液中砷、汞含量的测定 目的：观察组方中朱砂、雄黄所含的砷、汞是否能够被吸收入血或穿透血脑屏障进入脑脊液，从而探讨安宫牛黄丸的脑保护作用与朱砂、雄黄之间是否有一定的关联。方法：采用电感耦合等离子质谱法测定安宫牛黄含药血清、含药脑脊液中砷、汞的含量。 结论：安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液中有砷、汞的存在，含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对损伤神经细胞的保护作用的差异与朱砂雄黄可能相关。 结语： 1．安宫牛黄丸对胶原酶诱导的脑出血损伤有明显保护作用，可以降低损伤动物神经症状评分，降低脑指数、提高红细胞变形性、降低脑组织MDA含量，LDH活性、提高SOD酶活性，改善损伤脑组织病理形态。 2．安宫牛黄丸通过减少MMP9、AQP4的表达改善血脑屏障通透性，减轻脑损伤；通过影响Bax、Bcl-2的表达、以及促进MAPK通路中ERKmRNA，抑制P38mRNA、c-fos、c-jun表达发挥抗凋亡的作用，起到神经保护作用。 3．安宫牛黄丸含药血清、含药脑脊液对缺糖缺氧诱导的原代皮层神经细胞损伤有一定的对抗，可以降低损伤细胞的LDH漏出率，提高细胞活性。对谷氨酸诱导的原代皮层神经细胞损伤有一定的对抗，可以降低LDH漏出率，提高细胞活性，通过降低MDA含量、升高SOD活性、提高线粒体膜电位、减轻钙超载保护损伤的神经元。 4．去朱砂雄黄后对脑出血损伤仍表现一定的保护作用，简方减少c-fos、c-jun、P38mRNA表达的作用显著弱于全方，两者相应剂量组进行组问比较，有显著性差异。在其他指标上改善作用较全方有所减弱。但两种药物相应剂量组之间比较无统计学差异。简方含药血清、含药脑脊液对缺糖缺氧损伤、谷氨酸损伤原代皮层神经元表现出一定的保护作用，简方含药脑脊液对钙超载的抑制作用较全方含药脑脊液明显减弱，二者进行组间比较，差异有统计学意义。在其他指标上，改善作用较全方含药血清、含药脑脊液有所减弱。但两种药物相应剂量组之间比较无统计学差异。 创新点： 1．从整体药效学、血清药理学、脑脊液药理学三个层面研究和分析含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑出血大鼠损伤的保护作用及差异，明确朱砂雄黄在全方中存在的意义。 2．通过含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对大鼠脑出血损伤保护作用机制的探讨，明确朱砂、雄黄可能与安宫牛黄丸抗凋亡、抑制钙超载作用有关。 3．首次报道含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对于MAPK信号转导通路的影响。

目录

论文说明:英文缩略词

声明

综述一脑出血病理生理机制及治疗进展

综述二中医药对出血性中风的研究进展

前言

第一部分含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对大鼠脑出血损伤的保护作用及机制研究

(一)含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑出血损伤大鼠的保护作用

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

(二)含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑出血模型大鼠脑组织凋亡相关蛋白、血脑屏障通透性相关蛋白的影响

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

(三)含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑出血大鼠MAPK通路的影响

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

第二部分含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对原代培养大鼠皮层神经元损伤的保护作用及机理的研究(血清、脑脊液药理)

(四)含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对拟缺糖缺氧、谷氨酸诱导原代皮层神经元损伤的保护作用

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

(五)含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对原代皮层神经元线粒体膜电位、[Ca]i的影响

材料和方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

(六)含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄含药血清、含药脑脊液中砷、汞含量的测定

材料与方法

实验结果

小结

讨论

参考文献

讨论

结语

致谢

个人简历

附图