胎盘间充质干细胞的分离鉴定及木豆素促进间充质干细胞增殖的实验研究

摘要

组织工程修复大块组织缺损需要高浓度、大量的细胞接种。骨髓间充质干细胞(BMSCs)用于组织工程具有明显优势，但也存在着数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题。因此，有必要寻求组织工程种子细胞新的来源，以及摸索促进细胞规模化扩增的条件。
　　 目的：观察胎盘基质干细胞(HPMSC)的形态、生长情况及某些细胞生物学特征。了解HPMSC体外分化潜能，建立从胎盘组织中分离、纯化组织工程种子细胞的方法。观察木豆叶有效成分木豆素(cajanine)对BMSCs体外增殖及分化的影响，并进一步探讨木豆素促进BMSCs体外增殖的分子机制。
　　 方法：采用含有0.1％胶原酶Ⅳ，0.1％透明质酸酶，0.01％DNaseI的DMEM对剪碎的胎盘小叶进行消化，1.073g/ml Percoll梯度离心等方法进行HPMSC的分离、提取、纯化。参照培养BMSCs的方法对细胞进行培养。流式细胞仪分析HPMSC细胞表面抗原分子以及细胞周期。将HPMSC向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和神经元诱导分化，并进行相应检测。以木豆素作用于BMSCs，观察BMSCs增殖和碱性磷酸酶活性变化；对BMSCs进行成骨和成脂肪诱导，油红“O”染色和Von Kossa染色法观察木豆素对BMSCs分化能力的影响。以木豆素作用于细胞24h后，应用蛋白阵列筛选出磷酸化的蛋白和激活的细胞周期蛋白。
　　 结果：经过分离纯化的HPMSC接种后6～12h后贴壁，72h后出现纺锤状细胞，3～7d细胞生长迅速，形成克隆，贴壁的HPMSC约1～2w后细胞近80～90％汇合，出现致密的贴壁层。传代后细胞生长仍然旺盛。HPMSC的表面抗原分子CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD166+、HLA-DR-，与BMSCs类似。分离的细胞表型均一，表明所获细胞纯度较高。进行体外诱导后能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经元细胞。木豆素作用于BMSCs可以显著刺激其增殖，对其表达碱性磷酸酶活性无明显影响，木豆素可以提高BMSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化的效率。木豆素作用于细胞后，RB，CDK1，PDK等5个蛋白发生了磷酸化水平改变，cyclinB1、cyclinD、Cdc25B、cyclinE等8种细胞周期蛋白表达升高，一种细胞周期素降低。
　　 结论：1.人胎盘中存在大量的间充质干细胞，可以采用酶消化的方法分离，以密度梯度离心的方法、或克隆挑选法进行纯化。2.HPMSC有一定的增殖能力，在适当的培养条件下可多次传代，条件培养液诱导下可向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和神经元分化。3.进行流式细胞仪细胞表面分子鉴定显示：HPMSC与骨髓基质干细胞BMSCs有相似的细胞表型，表达CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD166+、HLA-DR-。4.木豆素具有促进BMSCs体外增殖的作用，同时不会使BMSCs失去向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力。5.木豆素能激活Rb/E2F-cyclinE信号通路，促进细胞向G1/S期的转变。6.木豆素能激活CDK1-cyclinB1蛋白复合物，上调CDC25B的表达，加速细胞向G2/M期的转化。