重组人促卵泡激素检定用标准物质的研究

摘要

人促卵泡激素(human follicle stimulating hormone，hFSH)是垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素。作为药物，广泛用于治疗垂体功能低下的不孕不育，和人类辅助生殖技术。近几年随着基因工程技术的发展，重组型人促卵泡激素以高纯度、无毒副作用的优点渐渐替代天然提取型，已大量用于临床治疗。鉴于此种情况，对此类药物制定严格的质量控制标准是非常必要的。但是，国外现仅有重组人促卵泡激素国际生物标准品未有重组人促卵泡激素国际理化对照品；我国也还没有重组人促卵泡激素的国家对照品和标准品。本实验的目的是通过对重组人促卵泡激素（rhFSH）的结构确证，质量研究及实验方法学的优化进行了较为全面系统的研究。为建立我国国家重组人促卵泡激素（rhFSH）标准物质及理化对照品奠定了基础，并完善了重组人促卵泡激素（rhFSH）质控技术标准。
　　本实验首先进行了重组人促卵泡激素(rhFSH)结构确证部分的研究分析。三种不同方法测定分子量，SDS－PAGE测定表观分子量为43KD，SEC-HPLC法测量分子量大约在43KD和!3.7KD之间，MALDI-TOF测的结果两个亚基分别为14.2KD和17.4KD，rhFSH分子量为31.6KD，与文献报道(31KD)一致。同时从紫外光谱分析，测得rhFSH最大吸收波长在276.6nm处。等电聚焦分析rhFSH样品范围在3.5～5.5之间。免疫鉴别印迹结果rhFSH对照品和rhFSH样品均为阳性，而rhCG样品免疫印迹鉴别结果为阴性。再结合肽图分析等几个方面进行对上述实验的分析，对重组人促卵泡激素(rhFSH)结构得到了基本确证。
　　接着进行了重组人促卵泡激素(rhFSH)原液质量部分的研究。使用Lowry法测定蛋白浓度为0.876mg/ml。用非还原 SDS－PAGE检测解离亚基小于5％。利用SDS-PAGE(银染)检测聚合体的含量小于2％。使用Wister大鼠测量 rhFSH生物活性：测得效价 PT=8087.5IU/mL,效价的可信限率为FL=21.014%,效价的可信限范围为6548.1～9947.1IU/mL。结合数据，基本对rhFSH原液质量部分进行确认。
　　在实验当中，对重组人促卵泡激素(rhFSH)的检测实验进行了部分方法学的研究与优化。rhFSH切糖试验中，经过反复试验和对比，增加了一步中高温加热反应，优化了还原条件，使切糖试验结果更稳定，效果更明显。并比较自研方法和传统试剂盒的切糖结果，证明前者切除 rhFSH的糖链适宜，而后者对于切除rhFSH的糖链不太适宜。，优化了切糖试验反应还原条件，并比较自研方法和传统试剂盒的切糖结果；在rhFSH肽图试验中，优化了裂解肽段反应的条件，同时比较分析了去除糖链前后的肽图图谱，证明两者的峰数和峰高度都不同，而且两者的裂解位点也有所区别。
　　通过以上的全面系统的实验研究，对重组人促卵泡激素（rhFSH）标准物质及理化对照品的研制提供了数据及理论依据。

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前言

第一部分 重组人促卵泡激素(rhFSH)结构确证部分研究

第一章 实验材料

第二章 重组人促卵泡激素(rhFSH)结构确证部分的方法学研究与优化

第三章 实验步骤及实验结果

第四章 讨论与小结

第二部分 重组人促卵泡激素(rhFSH)原液质量的部分研究

第一章 实验材料

第二章 实验步骤及实验结果

第三章 讨论与小结

第三部分 总结

参考文献

综述

参考文献

致谢

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