人精子膜蛋白YWK-Ⅱ蛋白/APLP2与穆勒氏管抑制性物质（MIS）的相互作用及其信号传导通路

摘要

为深入研究YWK-Ⅱ蛋白/APLP2和MIS的相互作用以及作为受体可能介导的信号传导通路,首先采用RT-PCR并结合限制性内切酶酶切的方法筛选了实验室常用细胞系,包括CHO细胞、COS-7细胞、Hela细胞、HEK293细胞、F11细胞、PC12细胞和SK-N-SH细胞,发现所检验的细胞系均表达YWK-Ⅱ蛋白/APLP2.选择CHO细胞作为研究YWK-Ⅱ蛋白/APLP2和MIS相互作用的细胞模型.将YWK-Ⅱ蛋白/APLP2的胞外近膜区226个氨基酸(HSD226)于大肠杆菌中大量表达,经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔,制备了高滴度的抗HSD226抗体.构建融合表达小鼠IgG κ链信号肽和绿色荧光蛋白的YWK-Ⅱ蛋白/APLP2的真核表达质粒,命名为pEGFP-N1-SYP,转染CHO细胞,经细胞荧光和免疫荧光观察,融合表达的EGFP-YWK-Ⅱ蛋白/APLP2定位于CHO细胞的细胞膜上.筛选稳定表达EGFP和EGFP-YWK-Ⅱ蛋白/APLP2的CHO细胞系,以此细胞系为模型,首先研究了rMIS(303-376)对稳定表达EGFP-YWK-Ⅱ蛋白/APLP2的CHO细胞系、稳定表达EGFP的CHO细胞系和CHO细胞的增殖的影响.通过研究YWK-Ⅱ蛋白/APLP2与MIS的受体一配体关系,了解两者相互作用后的信号传导通路,可为研究YWK-Ⅱ蛋白/APLP2与MIS的功能的多态性提供新的线索,为阐明MIS促进精子存活力和活动力的分子机制提供实验依据.

目录

前 言

实验材料

实验方法

1原核和真核细胞表达质粒的构建

2重组蛋白的表达及纯化

3多克隆抗体的制备效价检测

4细胞的培养和转染

5细胞实验

实验结果

一不表达YWK-II蛋白/APLP2的细胞系统的筛选

二HSD226表达及抗体制备

三融合表达小鼠IGGK信号肽和绿色荧光蛋白的YWK-II蛋白/APLP2的真核表达质粒的构建

四融合表达小鼠IGGK信号肽和绿色荧光蛋白的YWK-II蛋白/APLP2在CHO细胞中的定位

五稳定表达EGFP和EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞系的筛选

六融合蛋白HIS6-RMIS（303-376）的表达和纯化

七RMIS（303-376）促进表达YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞的增殖

八RMIS（303-376）促进稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞C-JUN的表达

九ANTI-HSD226抑制YWK-II蛋白/APLP2与GST-RMIS142的结合

十RMIS（303-376）对表达YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞中ERK1/2的激活作用及其信号传导途径

讨 论

小 结

参考文献

综述一studies on signal transduction pathway of aplp2 in reproduction system profiling its roles in nervous system

综述二GTP 结合蛋白GO的研究进展

附 录：英、汉名词对照

致 谢