中国汉族人CYP2C9遗传多态性与华法林剂量调整的研究

摘要

华法林是目前应用最广泛的口服抗凝药，用于静脉血栓、肺栓塞、心脏瓣膜置换术及房颤导致的血栓形成的预防和治疗，以及降低心梗复发及心梗后血栓栓塞死亡的危险。临床上使用的华法林是S-华法林和R-华法林的消旋体混合物，其中，S-华法林为优对映体，其抗凝活性是R-华法林的3～5倍，在体内，主要由细胞色素P-450酶2C9(CYP2C9)代谢。CYP2C9有两个重要的单核苷酸多态性(SNP)-CYP2C9*2和CYP2C9*3，国外研究表明，具有这两种突变的个体所需华法林剂量明显降低，达到稳定的剂量-效应关系时间明显延长，药源性出血的风险也随之增加。然而，国内在这方面还没有深入系统的研究。因此，本课题从中国汉族人CYP2C9*2和CYP2C9*3基因型的分布、CYP2C9*2和CYP2C9*3与中国人华法林剂量、稳态总浓度、稳态游离浓度及凝血酶原时间国际标准比值(INR)五者的关系等方面进行研究，初步探讨中国人CYP2C9遗传多态性等因素对华法林剂量的影响。本课题首先建立了聚合酶链式反应(PCR)-限制性片断长度多态分析(RFLP)的方法，对123名长期口服华法林的中国汉族患者的CYP2C9*2和CYP2C9*3分布情况进行分析，PCR产物直接测序验证酶切结果的准确性。结果表明，服华法林患者CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因的发生率分别为3.7％和0.4％。另外，本课题证实了中国人存在CYP2C9*2突变，推翻了以往认为中国人不存在该突变位点的观点。 其次，首次在国内采用环糊精柱分离血浆中的华法林对映体，HPLC法测定它们的浓度，该方法灵敏准确，重现性好，在12.5～2500ng·ml-1范围内线性良好，能够满足临床血浆华法林对映体浓度测定的需要。 再者，建立了人血浆中华法林对映体游离浓度的测定方法。先向血样中加入华法林对照品，超滤法分离游离华法林，HPLC法测定超滤前及超滤后华法林对映体浓度，计算患者的游离分数(fu)，再乘以其血浆华法林对映体总浓度，即得到游离浓度。该方法简便、准确，重现性好，适用于临床血浆中华法林对映体游离浓度的测定。 在此基础上，收集了123名服华法林达稳态(10天～6年)患者的血标本，分别测定血浆华法林稳态对映体浓度，同时记录患者的年龄、性别、体重、华法林剂量、INR值。经统计分析，发现：不同年龄组间华法林剂量有显著差别(P＜0.01)，60岁以上的患者，随着年龄的增长，华法林剂量有降低趋势；INR值在有效抗凝范围(1.5～3.5)时，血浆S-华法林稳态浓度范围为140.4ng·ml-1～826.9ng·ml-1，R-华法林稳态浓度范围为203.0ng·ml-1～1568.5ng·ml-1。华法林剂量与体重、INR值、血浆S-华法林、R-华法林及总华法林稳态浓度均呈显著正相关；INR值与血浆S-华法林、R-华法林及总华法林稳态浓度均呈显著正相关。说明测定血浆稳态华法林对映体特别是S-华法林浓度能够反映华法林的剂量和作用效果，可以作为华法林剂量调整的依据之一。 其次，选择了18名血浆华法林总浓度与INR值不相关的患者，考察了血浆华法林游离浓度与INR值的相关性，结果表明：18名选定的患者中，INR值与血浆S-华法林和R-华法林稳态游离浓度均有显著相关性。说明，血浆华法林对映体稳态游离浓度比总浓度更能反映华法林的抗凝效果。 最后，考察了CYP2C9遗传多态性与华法林剂量和抗凝效果的关系。收集123名中国汉族服华法林患者血标本，记录服药期间的用药剂量、INR值及出血情况，将患者按CYP2C9*1纯合体组和CYP2C9*3杂合体组分为2组，进行统计分析，结果表明，CYP2C9*1纯合体组和CYP2C9*3杂合体组华法林剂量、血浆稳态R-华法林与S-华法林色谱峰面积比(R∶S)、治疗初始阶段抗凝过量的发生率、达稳定剂量-效应关系的时间均有显著差别，CYP2C9*3杂合体组华法林平均剂量比CYP2C9*1纯合体约低1.5mg，降低了45.5％，CYP2C9*3杂合体组血浆稳态R-华法林与S-华法林色谱峰面积比(R∶S)比CYP2C9*1纯合体组降低了32.1％，达稳定剂量-效应关系的时间比CYP2C9*1纯合体组延长约8.6天。CYP2C9*1纯合体组和CYP2C9*3杂合体组华法林治疗初始阶段出血的发生率无显著差异。以上结果提示，通过CYP2C9基因型预测华法林剂量，可以减少抗凝过量的发生，缩短剂量调整的时间。 本课题得出的初步结论是：血浆稳态华法林对映体浓度测定能够反映华法林的抗凝效果，可以作为华法林剂量调整的参考；血浆稳态R-华法林与S-华法林色谱峰面积比(R∶S)反映了S-华法林相对于R-华法林的代谢情况，CYP2C9*3杂合体患者R∶S值低于1.5；血浆稳态华法林对映体游离浓度比总浓度更能反映华法林的抗凝效果；患者用药前进行CYP2C9基因型检测，预测华法林用药剂量，可以减少抗凝过量的发生，缩短剂量调整的时间，具有一定的临床意义。 本课题的创新之处在于： 1.首次在国内采用β-环糊精柱分离血浆稳态华法林对映体，HPLC法测定它们的浓度，该方法灵敏、准确、精密。 2.以入选的123名患者为基础，给出INR值在有效抗凝范围(1.5～3.5)时，血浆稳态S-华法林和R-华法林浓度范围分别为140.4～826.9ng·ml-1和203.0～1568.5ng·ml-1： 3.认为60岁以上的患者华法林平均日剂量较60岁以下者约降低1mg； 4.首次在中国汉族人中发现CYP2C9*2突变型； 5.认为中国汉族CYP2C9*3杂合体患者华法林日维持剂量约为1.8mg，比CYP2C9*1纯合体患者(3.3mg)降低了45.5％。 这些都可以作为临床华法林剂量调整的依据。

目录

英文缩略词

摘要

前 言

第一部分123名中国汉族服华法林患者CYP2C9遗传多态性分析

第二部分立体选择性高效液相色谱法测定人血浆中华法林对映体浓度

第三部分超滤法及高效液相色谱法测定人血浆中华法林对映体游离浓度

第四部分血浆华法林对映体总浓度及游离浓度对华法林剂量和INR值的影响

第五部分CYP2C9遗传多态性对华法林剂量和抗凝效果的影响

全文总结

综述一影响华法林疗效的因素分析

综述二关注制剂中辅料的不良反应

综述三药师与危险药物的处置

致谢