B7-H1在白血病细胞中表达及其在T细胞免疫调节中作用的初步研究

摘要

B7-H1是近年来发现的B7家族新成员。通过与T细胞表面的受体结合可以调节T细胞的分化与激活作用。B7-H1可以刺激静止T细胞分泌IL-10，诱导活化T细胞的凋亡。PD-1是B7-H1的受体，可以通过调节细胞周期而抑制活化T细胞的反应。B7-H1的mRNA表达在多种组织，而其蛋白在正常组织中的表达仅限于巨噬系统。B7-H1广泛表达于多种肿瘤细胞，肿瘤细胞的B7-H1可以增加抗原特异性T细胞的凋亡，进而促进肿瘤的生长。最近的研究表明B7-H1调节正常组织的耐受，有利于肿瘤侵袭，是肿瘤细胞免疫逃逸的一个重要机制。目前B7-H1在白血病细胞中的表达及作用所知甚少。本研究检测了B7-H1在白血病细胞中的表达，并初步探讨了其在T细胞免疫调节中的作用。 一、B7-H1在白血病细胞中的表达分别应用SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR、免疫细胞化学及WesternBlot方法检测了白血病细胞B7-H1的表达。 (1)应用SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法分别检测了9株人类白血病、2株肿瘤细胞系、74例初治白血病患者(ALL19例、AML40例、CML15例)、5例复发患者、10例正常供者骨髓单个核细胞(BMMNC)B7-H1基因的表达。同时跟踪检测了12例诱导化疗后获得完全缓解(CR)患者BMMNC上B7-H1基因的表达。结果显示①B7-H1mRNA在白血病细胞系中均有表达，但表达水平较低。经IFN-r诱导后，B7-H1表达上调。②B7-H1mRNA在初治白血病患者BMMNC中的总体表达水平较低，低于正常供者；在获得CR的12例白血病患者中B7-H1的表达高于CR前，亦高于74例初治患者及正常供者，复发患者表达水平高于初治患者。 (2)应用SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法分别检测了6例CR后应用G-CSF动员的ALL患者、10例初治白血病患者BMMNC诱导生成DC上B7-H1基因的表达，结果显示，动员后B7-H1基因的表达较正常人及动员前的初治ALL患者明显升高。白血病患者诱导生成DC上B7-H1基因的表达亦显著高于正常人BMMNC诱导生成DC和初治白血病患者的表达水平。 (3)免疫细胞化学显示白血病细胞系及初治患者骨髓细胞中不能检测到B7-H1蛋白的表达。但IFN-γ诱导后的细胞系中可在90％的细胞膜上检测到B7-H1的表达；WesternBlot方法检测结果显示，B7-H1蛋白在初治白血病患者中表达较弱，但在初治患者BMMNC诱导生成DC中表达较强。 (4)对74例初治白血病患者的临床资料分析后显示，B7-H1表达与患者的性别、年龄、外周血WBC数、骨髓中幼稚细胞比例、CD34表达是否阳性均无显著相关性，但与患者治疗反应有明显的相关性。8例未达CR的急性白血病患者初治时所检测的B7-H1基因表达水平明显高于27例治疗达CR患者初治时的表达水平，且差异具有显著性(P=0.005)。初步明确了B7-H1基因在白血病中的表达及临床意义。 二、白血病患者BMMNC诱导生成DC上B7-H1高表达及其在T细胞免疫调节中作用的初探。应用单抗封闭白血病患者BMMNC诱导生成DC上B7-H1，并与异源T细胞共孵育，应用ELIspot、ELISA及放射免疫化学法检测了培养上清液中细胞因子含量的变化。结果显示： ①与未封闭组(对照组)相比，封闭B7-H1后，IL-10含量下降(218.18±37.66vs125.34±22.24pg/ml)，IFN-γ含量显著升高(21±13.4vs158.5±50.34pg/ml)，差异均具有显著性。IL-4含量下降，IL-12含量升高，IL-2和TNF分泌量很低，差异均无显著性。 ②通过流式细胞仪，应用Annexin-V/PI双染检测白血病患者来源DC与异源T细胞作用后DC与T细胞的凋亡。分为4组，第1组：对照组，未加任何抗体；第2组：加入B7-H1单抗组；第3组：加入PD-1单抗组；第4组：加入B7-H1和PD-1单抗组。结果显示：DC凋亡率较低，加入PD-1单抗组最低，但4组间比较，差异均无显著性。T细胞凋亡率在第1组最高，第3组和第4组均较低，第1和2组间，第3和4组间T细胞凋亡率的比较差异均无显著性。但第3和1组间，第3和2组间T细胞凋亡率比较差异具有显著性(P分别为0.025和0.008)。第4和1组间，第4和2组间T细胞凋亡率比较差异亦具有显著性(P分别为0.01和0.003)。 表明白血病患者来源DC可以通过高表达B7-H1而调节T细胞免疫反应。封闭B7-H1后，T细胞分泌IL-10降低，IL-12及IFN-γ升高。阻断B7-H1/PD-1途径可以显著降低T细胞的凋亡。

目录

摘要

前言

第一章B7-H1在白血病细胞中表达的研究

一、材料与试剂

二、实验方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第二章B7-H1在T细胞免疫调节中的作用

英文缩略词表

B7-CD28家族共刺激途径在T细胞免疫调节中的作用及应用

致谢

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