人促血液血管细胞生成素功能性受体的探索和靶向粘附斑激酶（FAK）的RNA干扰研究

摘要

第一部分：人促血液血管细胞生成素的功能性受体nucleolin的鉴别 人促血液血管细胞生成素(HAPO)是实验室首先报道的一种对血液血管干细胞有促增殖作用的细胞因子。对HAPO的生物学功能研究发现，HAPO体外可以促进成人骨髓细胞的增殖。对胎儿骨髓的培养中，我们发现HAPO可以促进骨髓的造血细胞(悬浮细胞)和基质细胞(贴壁细胞)的增殖，因而推测HAPO主要作用于早期的造血干细胞和内皮细胞。体外实验中还发现HAPO可以通过激活PI3K-Akt信号传导途径抑制白血病细胞系MO7e的凋亡。此外，稳定转染HAPO的小鼠骨髓基质细胞体外具有造血支持作用。虽然对HAPO的生物学功能和信号通路有了一定的理解，但是HAPO的受体还未知。 在本研究中，在体外实验中发现HAPO可以促进人脐静脉来源的细胞系ECV304的粘附和迁移，并呈现剂量的依赖性。由于其他已经研究的细胞或者因为技术上的难度不容易获得或者需要依赖细胞因子生长从而代价昂贵，因此选择ECV304细胞作为研究HAPO受体的靶细胞。通过生物素标记的HAPO与ECV304细胞孵育发现HAPO确实可以结合在ECV304细胞上。进一步利用免疫共沉淀的方法发现HAPO组较对照组多了一条110KD的蛋白带，将该条带送到国家生物分析中心进行质谱测序，通过和基因库里的序列比较发现该蛋白是核仁蛋白(nucleolin)。由于核仁蛋白是主要表达于核内的蛋白质，所以首先检测了核仁蛋白在ECV304细胞膜上的表达。分别利用流式细胞术、提取膜蛋白的方法检测蛋白的表达，最终发现核仁蛋白确实表达在ECV304细胞的细胞膜上，这与已经报道的文献吻合。进一步实验中，利用蛋白质overlay的方法检测到在物理水平上HAPO与核仁蛋白确实可以互相结合。活细胞共定位实验进一步证明了HAPO在活细胞的水平上也可以与核仁蛋白相结合。为了证明核仁蛋白是HAPO的功能性受体，利用核仁蛋白的抗体进行了阻断实验，发现在有100倍摩尔浓度的核仁蛋白抗体存在的情况下，HAPO对ECV304细胞的促粘附作用受到了抑制，因此可以确定表达在细胞表面的核仁蛋白是HAPO的功能性受体。为了进一步确认这一点，构建了pcDNA3.1-nucleolin载体，并将其转染到细胞表面核仁蛋白阴性的人胚肾上皮细胞HEK293中，转染后16小时，利用流式细胞术的方法检测细胞表面的核仁蛋白的表达，发现16小时后293细胞表面确实表达了核仁蛋白。利用转染后的细胞进行迁移实验，发现与未转染细胞以及转染对照质粒的细胞相比，HAPO大大促进转染细胞的迁移。这些结果进一步说明了核仁蛋白是HAPO的功能性受体。 总之，鉴定了核仁蛋白是HAPO的功能性受体，并发现它与HAPO的一些生物学功能相关，这值得进行进一步的研究以加深对HAPO生物学功能和作用机制的理解。 第二部分FAK在人白血病细胞系k562中的表达与细胞的增殖、分化细胞周期、药物敏感性的关系 研究背景：粘附集中点激酶(FAK)是一个粘附集中点激酶(FAK)是一个非受体型的酪氨酸激酶，定位在细胞与细胞外基质接触的地方，即粘附集中点(focaladhesion)。FAK可以协调来自整合素(integrin)、细胞因子、生长因子受体以及原癌基因的信号，从而调节细胞的很多活动，如：增殖、凋亡、迁移、细胞周期等。FAK在多种类型的肿瘤细胞中过表达或持续活化，并与肿瘤细胞的运动、浸润、增殖的增加有关。虽然FAK在实体瘤中的研究进展已经很多，但是关于FAK在正常骨髓细胞和白血病细胞中的表达和作用的研究还十分少。 目的：利用Bcr-Abl阳性的慢粒细胞系k562，通过RNA干扰的方法来研究FAK对慢粒白血病细胞的功能的影响。 方法：合成针对FAK序列的寡核苷酸，退火后，经酶切连接入可以表达短发夹RNA的pGE-1载体，将载体转染入人慢粒白血病细胞系k562中，经G418筛选，得到稳定转染载体的细胞株，经过RT-PCR、westernblot两种方法鉴定干扰的效率。随后采用MTT染色检测干扰FAK表达后，k562细胞的增殖情况。采用PI染色法，通过流氏检测和软件计算来检测干扰后细胞周期的变化。转染干扰质粒和对照质粒的细胞分别加入化疗药物阿糖胞苷孵育48小时，然后分别利用annexinv/PI染色法和联苯胺染色法来检测细胞对药物的敏感性以及分化的情况。 结论：所选取的片段可以有效地干扰k562细胞中FAK的表达，干扰FAK表达后，细胞的增殖被抑制、细胞周期被推迟、对药物的敏感性增加，细胞的分化增多，结果显示，FAK有可能成为治疗慢粒白血病的一个新的靶目标。

目录

第一部分：人促血液血管细胞生成素的功能性受体nucleolin的鉴别

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 FAK在人白血病细胞系k562中的表达与细胞的增殖、分化细胞周期、药物敏感性的关系

核仁蛋白：结构、功能和定位

粘着斑激酶与肿瘤

附录一缩略词

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