与疾病相关的离子通道表达和功能研究

摘要

本论文旨在研究原发性红斑肢痛症和脑缺血这两种疾病中不同离子通道的变异、调节和功能变化在疾病中的作用。 第一部分原发性红斑肢痛症相关的离子通道功能改变。原发性红斑肢痛症是一种常染色体显性遗传病，主要临床表现为四肢末端反复发作的阵发性对称性灼痛，热刺激或运动后加重，遇冷后可部分缓解，现在尚无很好的治疗药物。其病因和病生理机制长期以来并不清楚，最近研究发现电压依赖性钠离子通道Nav1.7突变可导致原发性红斑肢痛症的疼痛等相关症状。采用全细胞膜片钳技术先后研究了在中国人群中发现的两例原发性红斑肢痛症的Nav1.7通道突变L858F和V872G的电生理功能学变化，并探讨了温度降低缓解原发性红斑肢痛症疼痛的机理。 一、本研究中的L858F突变的受累者为两名儿童，其父亲为无症状的嵌合体。对稳定转染野生型Nav1.7和Nav1.7-L858F突变体的细胞的钠通道各项电生理学参数进行了比较。我们发现：与野生型相比，L858F突变使得稳态半数激活电位向超极化方向移动约9mV，稳态半数失活电位向去极化方向移动约3mV，L858F突变还使得Nav1.7通道的去活化速度显著变慢，此外通道的复活速度在突变后显著加快，而关闭态失活速度则显著变慢，L858F突变还显著增大Navl1.7通道的斜坡电流，约为野生型的4倍。这些结果提示L858F突变使得Nav1.7通道发生“功能增强”的变化，从而使得表达Nav1.7的外周感觉神经元电兴奋性增强，原发性红斑肢痛症患者表现出相关的疼痛症状。 二、降温可以部分缓解原发性红斑肢痛症的疼痛症状，因此在对L858F突变体电生理学功能研究的基础上，又观察了温度变化对Nav1.7通道野生型和L858F突变体门控特性的影响。在实验中分别选择了16℃、25℃和35℃作为参照温度。研究发现：对于Nav1.7野生型通道和L858F突变体，温度降低都使得通道电流密度降低，去活化速度变慢，以及斜坡电流增大。此外温度降低后野生型通道的稳态半数激活电位没有发生显著性变化，而L858F突变体的稳态半数激活电位却向去极化方向移动，所以低温下突变体的激活阈值更接近野生型，这可能是降温缓解原发性红斑肢痛症疼痛的生理基础。 三、本研究中V872G突变所累及的患者为一散发病例，对稳定转染该突变体的细胞株和转染野生型Nav1.7通道的细胞株电生理学研究发现：V872G突变使得Nav1.7通道稳态半数激活电位向超极化方向移动约3mV，稳态半数失活电位向去极化方向移动约7mV，突变后通道的去活化速度变慢，复活速度加快，而关闭态失活速度变慢，此外V872G突变还使得Nav1.7通道的斜坡电流增大至野生型的2.5倍。因此，认为Nav1.7通道的V872G突变也是一种“功能增强”的突变，导致感觉神经元异常放电，患者产生疼痛反应。 总之，研究表明在原发性红斑肢痛症中新发现的Nav1.7通道的L858F和V872G突变都是使得钠通道发生“功能增强”的变化，表达Nav1.7通道的神经元电兴奋性增强，导致患者表现出相关的疼痛症状。温度降低后使得突变体和野生型钠通道激活阈值差异减小，疼痛得以缓解。 第二部分瞬时受体电位通道亚型在大鼠脑缺血中的基因表达及药理学研究。瞬时受体电位通道(Transient Receptor Potential Channel，TRP Channel)是一类重要的非选择性阳离子通道，因其分布广泛，参与细胞众多基本生理功能，近年来成为离子通道领域研究的热点。脑缺血是脑血管疾病中最主要的类型，严重危害着人类的健康。脑缺血发生时以及缺血后再灌注可引起神经元缺氧、氧自由基爆发和酸中毒等众多病理生理学变化。以往研究报道瞬时受体电位通道TRPM2和TRPM7亚型可被包括缺氧和氧自由基等在内的多种因素所调节，在神经元死亡中起着重要的作用。为此，应用大脑中动脉阻断方法建立大鼠急性短暂性脑缺血模型和持续性脑缺血模型，采用Real—Time PCR的方法分别检测了这两种病理损伤过程中大鼠皮层和海马不同时间点的TRPM2和TRPM7通道mRNA表达的变化。 对大鼠大脑皮层的研究发现：在短暂性脑缺血中，TRPM2 mRNA在缺血2h后再灌24h时表达显著降低，减少了66.3％，TRPM7 mRNA在再灌2h、12h和24h时表达都显著降低，分别减少了47.2％，50.9％和68.9％。；在持续性脑缺血中，TRPM2 mRNA在缺血2h、12h和24h时表达都显著下降，分别减少了27.5％，55.9％和19.6％，TRPM7 mRNA在缺血2h和24h时表达亦显著下降，分别减少了26.6％和34.4％。对大鼠大脑海马的研究发现，在短暂性脑缺血中TRPM2mRNA表达在缺血2h后再灌的各个时间点都没有显著性变化，TRPM7 mRNA在再灌6h时表达显著升高，增加了141.5％；在持续性脑缺血中TRPM2 mRNA在缺血2h和6h时表达显著升高，分别增加了47.5％和31.3％，TRPM7-mRNA亦在缺血2h和6h时表达显著性升高，分别增加了1188.5％和347.4％。结果表明无论TRPM2还是TRPM7在大鼠大脑皮层缺血和海马缺血的病理过程中的作用都不相同，特别是TRPM7可能在海马缺血中起着非常重要的作用。鉴于TRPM7通道的重要生理功能和病生理作用，构建了四环素调控的稳定表达TRPM7通道的细胞株。四环素诱导后TRPM7通道高表达，并产生TRPM7通道特异性电流，电流的大小对四环素剂量和诱导时间呈现出一定的依赖性。同时采用激光共聚焦成像技术观察了左旋丁基苯酞(1-NBP)，课题组自主研发的新型抗脑缺血药物，对表达TRPM7通道细胞的胞内钙离子的影响。结果发现1-NBP可以降低细胞内钙离子浓度，提示1-NBP对TRPM7通道可能具有一定的抑制作用。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

第一部分原发性红斑肢痛症相关的离子通道功能改变

前言

第一节原发性红斑肢痛症钠通道Nav1.7突变体L858F的电生理学研究

材料与方法

结果

小结

第二节野生型Nav1.7通道和原发性红斑肢痛症突变体L858F的温度依赖性研究

材料与方法

结果

小结

第三节原发性红斑肢痛症钠通道Nav1.7突变体V872G的电生理学研究

材料与方法

结果

小结

讨论

参考文献

第二部分瞬时受体电位通道亚型在大鼠脑缺血中的基因表达及药理学研究

前言

第一节大鼠短暂性脑缺血后大脑皮层和海马TRPM2和TRPM7mRNA表达的改变

材料与方法

结果

小结

第二节大鼠持续性脑缺血致大脑皮层和海马TRPM2和TRPM7mRNA表达的改变

材料与方法

结果

小结

第三节TRPM7基因稳定转染细胞株的建立及相关药理学研究

材料与方法

结果

小结

讨论

参考文献

全文总结

综述1 原发性红斑肢痛症致病机制研究进展

综述2 瞬时受体电位通道研究进展

附录

个人简历

致谢