表达人抗表皮生长因子受体单链可变区抗体的重组腺相关病毒载体的构建及胰腺癌细胞株对C225敏感性的评价

摘要

背景：胰腺癌早期诊断难，恶性程度高，预后差，传统的治疗手段效果有限，总的5年生存率不足5％。包括EGFR靶向治疗和基因治疗在内的一些新的治疗手段迅速发展：抗EGFR单克隆抗体可以竞争性结合EGFR，阻断EGFR信号通路，发挥抗肿瘤效应，代表药物C225已在胰腺癌Ⅱ期临床试验中证实可以增强吉西他滨的作用；胰腺癌的基因治疗也已进展到了Ⅱ期临床试验，新型载体腺相关病毒因其表达持久稳定、感染谱广、免疫原性和致病性弱、无致肿瘤作用的特点越来越引起研究者的重视。本实验旨在将基因治疗技术与抗EGFR靶向治疗相结合，构建表达人抗EGFR单链可变区抗体的重组腺相关病毒(rAAV)载体，并筛选出对抗EGFR抗体敏感的细胞株，为后续的体内实验和临床开展抗EGFR单链抗体基因治疗奠定基础。 方法： (1)以包含CMV增强子、CBA启动子、嵌合内含子、人IX因子基因、polyA的rAAV载体为骨架，以重叠延伸法在骨架上引入新的单酶切位点，然后通过酶切将hFIX基因去除，插入目的基因； (2)用构建成功的质粒转染293细胞，通过WesternBlot法和免疫细胞化学法检测目的蛋白的表达； (3)将C225作用于六株胰腺癌细胞，通过CCK-8法测定各细胞生长曲线，PI染色法及AnnexinV-FITC试剂盒检测细胞凋亡情况，筛选对C225敏感的细胞株。 结果： (1)hFIX基因两端引入了新的单酶切位点，通过常规克隆手段将hFIX基因替换为目的基因，测序结果符合预期； (2)利用GFP观察到293细胞的转染效率约为15-30％，利用WesternBlot法检测到了目的条带，同时免疫细胞化学法亦可观察到染色强弱的不同； (3)生长曲线显示C225对AsPC-1的生长有明显的抑制作用，其余五株则无，在第48、72小时AsPC-1的抑制率明显高于其它五株细胞，乙醇固定PI染色法未检测到细胞凋亡，AnnexinV-FITC与PI双染法可检测到C225引起AsPC-1细胞的早期凋亡。 结论： (1)包含抗EGFR单链抗体可变区基因的rAAV载体构建成功，并在293细胞中获得表达。 (2)AsPC-1对C225的敏感性明显高于其它五株胰腺癌细胞。

目录

缩略词表

摘要

背景

第一部分：表达人抗EGFR单链可变区抗体(scFv)的重组腺相关病毒(rAAV)载体的构建

第二部分：载体AAV2-CBA-scFv在293细胞中的表达

第三部分：抗EGFR单抗C225对六株胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

附图

结论

参考文献

综述单克隆抗体IMC-C225在胰腺癌EGFR分子靶向治疗中的应用

志谢