Drp-1基因参与高糖诱导胰岛β细胞凋亡的相关机制研究

摘要

目的：研究线粒体分裂蛋白(Dynamin-related protein 1，Drp-1)的表达对高糖诱导胰岛β细胞凋亡的影响，探讨线粒体分裂与β细胞凋亡的分子机制。 方法： 1)构建Drp-1和Drp-1K38A质粒，.应用基因转染技术在大鼠胰岛β细胞(INS-1)构建表达Drp-1野生型(Drp-1WT)和Drp-1突变型(Drp-1K38A)基因的可诱导细胞系，并用细胞免疫荧光和实时定量PCR(Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR)方法证实转染基因的可诱导性.，采用免疫蛋白印迹(Western blot)分析Doxycycline(Dox)诱导后胰岛β细胞Drp-1表达的时-效关系和量一效关系，确定Dox的最佳作用剂量和作用时间。 2)分析高糖条件下Drp-1基因的表达，.以及Drp-1的表达对胰岛β细胞增殖的影响：Real-time PCR和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbentassy,ELISA)分析Drp-1表达对胰岛素mRNA的表达和胰岛素释放的影响。应用生物化学的方法分析Drp-1表达对胰岛β细胞能量代谢的影响。应甩Annexin V-PI、Hochest33342-PI、TUNEL染色及DNA Ladder分析在高糖条件，.Dox诱导前后胰岛β细胞凋亡的情况。 3)应用免疫蛋白印迹(Western blot)方法比较不同糖浓度时，Dox诱导前后Drp-1的表达和细胞色素c的释放相关性。应用微孔板式连续荧光光谱仪测定不同条件下细胞内凋亡蛋白酶Caspase3的活性。应用透射电子显微镜和激光共聚焦显微镜观察Dox诱导前后线粒体的形态变化并在共聚焦显微镜下分析细胞色素c在细胞内的分布。应用流式细胞术比较Dox诱导前后细胞线粒体膜电位的变化和细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生。 结果： 1)Drp-1可诱导细胞系的鉴定：免疫荧光和Western blot的结果显示，Dox诱导后Drp-1基因表达在野生型(Drp-1WT)和突变型(Drp-1K38A)细胞系表达明显增加，并且Drp-1的表达与Dox之间存在明显的剂量-依赖和时间-依赖关系，500ng/ml Dox诱导24h后，Drp-1的表达即明显增加，96h达高峰。 2)Drp-1表达对胰岛β细胞功能的影响：MTT结果显示：Dox诱导后，细胞增殖和胰岛素分泌能力在Drp-1WT细胞明显降低，而在Drp-1K38A细胞变化不大，这种现象在高糖培养条件时更明显。能量代谢的实验结果显示：在高糖条件下，Drp-1WT细胞在Dox诱导后的呼吸酶复合体活性明显升高，ATP含量减少。凋亡的分析结果表明：在高糖条件下，经Dox诱导后Drp-1WT细胞的凋亡明显多于Drp-1K38A细胞。 3)Drp-1表达参与胰岛β细胞凋亡的机制：透射电镜和激光共聚焦显微镜观察发现：在高糖条件下，Dox诱导后的Drp-1WT细胞中的可见线粒体分裂和细胞色素c的释放。生物学分析结果表明：细胞中的线粒体膜电位降低、caspase3活性升高、ROS产生增加，而这些变化在Drp-1K38A细胞变化不明显。 结论：Drp-1基因表达参与高糖诱导的胰岛B细胞凋亡。

目录

论文说明：缩略语表

前言

材料与方法

一.主要实验试剂

二.主要仪器设备

三.主要实验方法

四、统计学分析

结果

一、可诱导的Drp-1WT和Drp-1K38A细胞系的建立

1.细胞培养与转染

2.转染细胞的鉴定

二、Drp-1过表达对β细胞功能的影响

1.Drp-1过表达对细胞增殖的影响

2.Drp-1过表达对细胞胰岛β细胞胰岛素合成与分泌功能的影响

3.Drp-1过表达对胰岛β细胞线粒体形态的影响

4.Drp-1过表达对胰岛β细胞能量代谢的影响

5.Drp-1过表达对胰岛β细胞凋亡的影响

6.Drp-1过表达对胰岛β细胞线粒体膜电位的影响

7.Drp-1过表达对胰岛β细胞细胞色素C释放的影响

8.Drp-1过表达对胰岛β细胞凋亡蛋白酶caspase3活性的影响

9.Drp-1过表达对胰岛β细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生的影响

讨论

结论

参考文献

综述一 线粒体形态与细胞凋亡的研究进展

综述二 胚胎干细胞向胰岛分泌细胞诱导分化的研究进展

个人简历

致谢