脂筏在TRAIL引起的细胞凋亡早期事件中的作用研究

摘要

TRAIL是TNF家族的成员之一，与其他成员不同的是TRAIL和其受体在绝大多数细胞和组织中均有表达，但TRAIL可选择性地杀伤肿瘤细胞，对大多数正常细胞没有细胞毒作用。由于这种特性的存在，TRAIL成为一种极具治疗前景的抗癌药物。然而，随着研究的深入，人们发现有许多肿瘤细胞对TRAIL并不敏感，这在一定程度上限制了TRAIL的应用。本研究利用实验室保存的两株对TRAIL敏感性不同的Jurkat T淋巴细胞为模型，探讨其敏感性不同的原因，重点关注TRAIL诱导细胞凋亡早期阶段的差别。 脂筏是细胞膜上的特殊微区，其中含有大量的胆固醇和鞘磷脂，因为这两种脂类的稳定性较强，可以使脂筏微区与其它磷脂双层分相，并为许多膜蛋白和病原体提供进出细胞和下传信号的平台。由于脂筏是接受大多数外界信号刺激的门户，本研究假定两株Jurkat T淋巴细胞对rsTRAIL敏感性不同的原因可能与脂筏有关。对于TRAIL的敏感性与脂筏微区关系的研究，目前还是空白。 首先以自己制备的重组可溶性TRAIL(rsTRAIL)处理两株Jurkat T淋巴细胞白血病细胞，发现二者对TRAIL细胞毒作用的敏感性存在明显差别。对TRAIL敏感的称JKS细胞，对TRAIL不敏感的称为JKR细胞。Western Blot分析显示，JKS细胞经rsTRAIL处理后，其细胞浆中的促凋亡分子procaspase—8和RIP表达减少，而在JKR细胞中检测不到这种变化。而且未经rsTRAIL处理的JKS细胞内procaspase—8的表达量也比JKR细胞为多。rsTRAIL处理使JKS细胞膜中的procaspase—8、RIP和FADD发生相应的募集或减少，而JKR细胞膜中的FADD和RIP未发生明显变化，procaspase—8则检测不到，提示procaspase—8表达量低可能是JKR细胞对TRAIL不敏感的原因。但是caspase—8抑制剂能全部抑制rsTRAIL引起的JKR细胞凋亡，但只能部分抑制JKS细胞凋亡，抑制率约为50％，表明procaspase—8的表达量差别不能完全解释这两株细胞对TRAIL敏感性的不同，procaspase—8的上游因素可能也影响细胞对TRAIL的敏感性。 进一步研究了两株细胞脂筏成分的变化，结果表明两株细胞受到TRAIL刺激后，募集促凋亡分子的能力不同。DR5、FADD、procaspase—8、RIP和PI3K-P85亚基在JKS细胞中均是脂筏预装蛋白，TRAIL刺激20分钟内DR5、FADD、procaspase—8和PI3K-P85亚基均增加，而RIP减少。尽管DR5和RIP在JKR细胞中是脂筏预装分子，但随TRAIL刺激的延长，并没有检测到两种分子的变化，而DISC复合物中的FADD和procaspase—8没有出现在脂筏样品中，PI3K-P85亚基只在20分钟时有轻微增加。 进一步研究显示，脂筏募集蛋白能力的这种差别与酸性鞘磷脂酶有关。JKR细胞中的酸性鞘磷脂酶较少，而JKS细胞中较多。该酶的活性分析表明，JKR细胞酸性鞘磷脂酶的活性较低，神经酰胺的增加和鞘磷脂的减少都不及JKS细胞明显，JKS细胞的酸性鞘磷脂酶的本底活性较JKR细胞为高，4小时时神经酰胺增加的倍数达到6.3倍以上。酸性鞘磷脂酶与脂筏的共定位研究显示，JKR细胞接受TRAIL刺激后，酸性鞘磷脂酶与脂筏逐渐共定位，有时空的变化。JKS细胞的酸性鞘磷脂酶与脂筏始终是密切共定位，不存在时空的变化。说明JKS细胞中的酸性鞘磷脂酶能够在脂筏原位发挥更强大的作用，利于脂筏中促凋亡分子的募集。 综上所述，两株JurkatT淋巴细胞中酸性鞘磷脂酶的含量、活性和定位的变化是其对TRAIL敏感性不同的重要原因。本项研究可为急性T淋巴细胞白血病的治疗和预后判断提供新的线索。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：所略词表

声明

第一章前言

第二章材料和方法

第三章结果

第四章讨论

第五章小结

参考文献

综述一脂筏与Fas信号传导——死亡受体信号转导模式的折射

综述二　胞吞通路中泛素和脂类在蛋白寻靶中的作用

附录

致谢