人SIRT1H363Y心脏特异转基因小鼠的建立及其导致扩张型心肌病和心力衰竭的机制研究

摘要

随着社会老龄人口逐渐增加，心力衰竭已经成为最为重要的心血管问题，也成为人们最为关心的健康问题之一。研究表明在扩张型心肌病中心肌细胞凋亡大量增加，导致心脏逐渐发展成为心力衰竭；心肌细胞凋亡也是发生扩张型心肌病和心力衰竭一个主要事件和中心机制。去乙酰化酶Sir2α(themurineorthologofsilentinformationregulator2)敲除的小鼠发生心脏发育缺陷，只有很少一部分敲除鼠可以存活下来；Sir2α对于氧化心激导致的心肌细胞凋亡具存保护作用。更重要的是：体外研究表明位点突变型的Sir2α(SIR2H355A)可以增加基础水平和过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡，但是在心脏中SIRT1去乙酰化酶的作用还仍然不清楚。 我们猜测：抑制心肌细胞中SIRT1的去乙酰化酶活性呵以增加心肌细胞凋亡，导致心脏的功能失常。为了验证这个假说，我们进行了如下的研究： 首先，在压力负荷导致大鼠心肌肥厚和心力衰竭模型心脏中检测SIRT1的表达，发现其表达相对于对照组表达显著增加。为了研究SIRT1的去乙酰化酶活性在体内的功能，将位点突变型的SIRT1(SIRT1H363Y)cDNA与α-MHC启动子连接，通过显微注射受精卵的方法制备了心脏特异性表达SIRT1H363Y的转基因小鼠，经过RT-PCR、SouthernBlot、Westernblot和免疫组织化学等方法证明SIRT1H3636Y在转基因小鼠心脏组织中特异性高表达。然而出乎意料的足：转基因小鼠心房和心室扩张，并且绝大部分在一周到一个月内死亡；幸运地，我们得到三株转基凶小鼠能够产生后代，但是这些后代大部分在8到12天内死亡。转基因小鼠心脏重量和体重的比例显著高于阴性同窝小鼠。分别用病理、超声心动图和分子检测诊断表明转基因小鼠发生扩张型心肌病；电子显微镜显示线粒体结构明显破坏和肌小节变性与降解；用TUNNEL方法进行凋亡分析发现转基因小鼠的心肌细胞发生凋亡的细胞数目显著多于阴性同窝小鼠。对于心肌细胞凋亡机制的研究发现转基因小鼠心脏中Bax的表达显著高于阴性同窝小鼠，同时Caspase-9发生显著剪切和Apaf-1的表达显著增高；而c-FLIP平Caspase-8并没有明显的改变。因此，Bax介导的线粒体途径的凋亡通路在转基因小鼠心肌细胞凋亡中起到主要作用。进～步研究SIRT1H363Y和Bax介导的细胞凋亡之间的内在关系，我们发现p53的乙酰化水平显著增加；在细胞水平，通过腺病毒过表达突变型的SIRT1(ad-SIRT1H363Y)同样可以导致原代培养心肌细胞中p53的乙酰化水平和Bax的表达显著增加。 综合上述结果可以得出结论：利用α-MHC启动子可以使SIRT1H363Y在心肌细胞中高表达。心脏组织特异性过表达SIRT1H363Y显著增加了心肌细胞凋亡，导敛心脏在早期就发生严重的扩张型心肌病，进而迅速影响心脏功能，最终导致心力衰竭和早期致死。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文名词及缩写

声明

前言

1.以心力衰竭为基础的心脏疾病对人类健康危害严重

2.心力衰竭是一个多因素多环节的漫长过程

2.1心力衰竭具有复杂病理生理过程

2.2心力衰竭可通过多种机制发生，有多种因素相互交错

3扩张型心肌病的主要症状是心力衰竭

4.心肌细胞凋亡(apoptosis)是扩张型心肌病和心力衰竭发生的重要环节

4.1心肌细胞凋亡途径包括外源性和内源性凋亡通路

4.2 Bcl-2家族蛋白是线粒体途径的心肌细胞凋亡中主要介导分子

4.3细胞凋亡途径作为治疗的潜在靶点

5.人SIRT1的功能提示它可能具有抗心肌细胞凋亡的作用

6.降低SIRT1的去乙酰化酶活性是否对心脏的功能有影响以及可能的分子机制是本研究的要点

实验材料

1.质粒

2.菌株

3.实验用大、小鼠及饲料

4.限制性内切酶和其他修饰酶

5.其他主要试剂

6.放射性核素

7.主要仪器设备

实验方法

1.克隆构建

1.1用于制备转基因的α-MHC-SIRT1H363Y的克隆构建

2.质粒DNA和重组腺病毒的制备与纯化

2.1质粒DNA的大量制备

2.2质粒DNA的酶切与纯化

2.3重组腺病毒的制备和检测

3.受精卵培养基的配制与保存

3.1 M2和M16储存液的成分及配制

3.2 M2和M16工作液的配制

4.小鼠的选择与处理

5.超排卵和取卵

6.显微注射

6.1持卵针的制备

6.2显微注射针的拉制

6.3显微注射槽的制备

6.4显微注射

7.输卵管移卵

7.1移卵针的制备

7.2受精卵在移卵针中的排列

7.3输卵管移卵

8.转基因小鼠的检测

8.1利用PCR鉴定转基因小鼠

8.2利用Southern杂交鉴定转基因小鼠

9.心肌肥厚动物模型建立

10.新生大鼠心肌细胞分离和培养

10.1心肌细胞的分离

10.2心肌细胞的纯化

10.3心肌细胞生长和活力观察

10.4心肌细胞的处理

11.心重和体重的测定

12.超声心动图分析

13.电子显微镜分析

14.组织RNA提取

15.组织蛋白提取部分

15.1蛋白提取缓冲液RIPA的成分

15.2用RIPA缓冲液提取组织蛋白

16.Western blot

16.1变性PAGE胶电泳

16.2转膜

16.3免疫反应

16.4 ECL反应

17.HE染色和Masson染色

17.1石蜡制片流程

17.2 HE染色流程(Harris苏木素-伊红染色法)

17.3 Masson染色

18.免疫组化

19.统计学方法

实验结果

1.压力超负荷诱导的大鼠心肌肥厚模型中SIRT1表达增加

2.α-MHC-SIRT1H363Y质粒克隆的构建

3.显微注射用DNA的制备

4.转基因鼠系的建立

4.1转基因鼠系的建立

4.2转基因鼠系的表达鉴定

4.3转基因小鼠中内源性的Sir2α表达

5.转基因在动物体内正确的组织特异性表达

6.转基因小鼠心脏扩张和早期致死

7.转基因小鼠发生扩张型心肌病

7.1心脏/体重的检测

7.2转基因小鼠的超声检查

7.3 α-MHC-SIRT1H363Y转基因小鼠的病理检查

7.4转基因小鼠的电镜检查

8.转基因小鼠心脏出现心力衰竭

9.转基因小鼠的心肌细胞凋亡增加

10.转基因小鼠的心肌细胞中caspase-3的活性增加

11.SIRT1H363Y上调心肌组织p53乙酰化水平和Bax基因表达的升高

11.1转基因小鼠心脏中Bax和TNF-α的表达增加

11.2转基因小鼠心脏中线粒体相关的分子发生明显的改变

10.3转基因小鼠心脏中Bax的mRNA表达显著增加

10.4转基因小鼠心脏中p53的乙酰化水平显著增加

10.5转基因小鼠心脏中p53的其他下游的改变

12.SIRT1H363Y导致原代培养的新生大鼠心肌细胞中p53乙酰化水平和Bax的基因表达的升高

讨论

1.转基因小鼠发生了扩张型心肌病和心力衰竭

2.转基因小鼠导致扩张型心肌病和心力衰竭的细胞机制

2.1转基因小鼠心肌细胞凋亡的增加

2.2转基因小鼠并没有发生明显的心肌肥厚和炎症

2.3单纯的心肌细胞凋亡导致扩张型心肌病和心力衰竭

3.转基因小鼠导致扩张型心肌病和心力衰竭的分子机制

3.1 P53乙酰化水平的升高和Bax基因表达的增加参与了SIRT1H363Y导致的扩张型心肌病和心力衰竭

3.2 Bax依赖的线粒体凋亡途径参与了SIRT1H363Y导致的扩张型心肌病和心力衰竭

3.3 SIRT1H363Y导致扩张型心肌病和心力衰竭的机制总结

4.SIRT1既是早期发育重要因子，又是参与正常的心肌细胞增长和病理性肥厚的重要因子

4.1 SIRT1参与心脏发育

4.2 SIRT1参与细胞生存和生理性增殖

4.3 SIRT1参与病理性心肌肥厚

5.本研究的不足与展望

参考文献

小结

文献综述 去乙酰化酶SIRT1的研究进展

致谢

个人简历