Exendin-4类似物-重组胰生定多肽(EXf)抗糖尿病作用的药效学评价及其机制的初步研究

摘要

Exendin-4(EX-4)作为肠降糖素的拟似物，已用于临床治疗2型糖尿病。EX-4与一种哺乳动物肠降糖素-胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)一样，能激活GLP-1受体(GLP-1receptor，GLP-1R)，作为调控血糖的药物使用。EXf是EX-4全长3/4的多肽片段，本研究的目的是评价EXf在体内和体外的生物学活性。
　　 在整体动物水平的研究发现，EXf在0.125-2.0mcg/kg剂量范围内，单次皮下注射，能使正常小鼠、肥胖性胰岛素抵抗MSG小鼠和自发性2型糖尿病KKAy小鼠的血糖有一定的降低作用。即使对于类似人类1型糖尿病的四氧嘧啶高血糖小鼠模型，EXf也能引起剂量依赖性的血糖降低。EXf能使正常小鼠和肥胖性胰岛素抵抗MSG小鼠口服葡萄糖负荷后的血糖升高幅度有明显的降低，且量效关系非常明显，EXf和EX-4在相同剂量下的作用相似。EXf还可引起正常ICR小鼠和KKAy小鼠糖负荷后I相胰岛素分泌明显增加，分别为3倍和2倍。EXf虽不能抑制黑色半固体食糜在正常小鼠胃中的排空，但可使其在小肠中的推进速率呈剂量依赖性减缓。然而EXf长期给药的结果表明，在所用的剂量范围内，对KKAy小鼠和四氧嘧啶高血糖小鼠的清晨非禁食血糖无明显影响。
　　 GLP-1作为可使细胞内腺苷酸环化酶活化的胃肠激素，在调节胰岛β细胞功能方面发挥着重要作用，如通过调节大鼠胰岛素基因I启动子(ratinsulin I genepromoter，RIP1)区域的cAMP反应元件(cAMP response element，CRE)来刺激胰岛素基因的转录。本研究通过瞬时转染的方法发现，在小鼠源性的胰岛β细胞株NIT-1中，EXf能促进RIP1-CRE调控的GFP报告基因的转录活性，且量效关系明显，GLP-1R的阻断剂EX(9-39)能阻断此作用，表明EXf属于GLP-1R的激动剂。尽管EXf引起NIT-1细胞内的第二信使cAMP水平升高，但cAMP-PKA途径似乎不参与EXf对RIP1-CRE调控转录活性的促进作用。
　　 有研究表明GLP-1R的激动对维持胰岛β细胞的数量也起着重要作用。在整体水平，根据对胰岛素需求量的动态变化，机体通过增殖和凋亡两条途径在不停重塑β细胞的数量。本研究也评价了当促凋亡因子放线菌素D和H2O2作用细胞时，EXf是否有保护作用。结果表明在NIT-1细胞，EXf能改善促凋亡因子引起的细胞活力下降和减少促凋亡因子引起的DNA片段化。EXf预防凋亡发生的机制与增加促存活蛋白PKB的表达、减少细胞内caspase-3的含量有关。本研究发现，与以往肠降糖素对抗凋亡的研究报道不同，EXf不需预先与细胞作用就可起到对抗凋亡的作用。
　　 总之，EXf作为EX-4的类似物，在整体动物水平有着与EX-4相似的血糖调节作用和生物学活性。在离体水平，EXf可增强RIP1-CRE介导的转录活性，有望改善p细胞的分泌功能；EXf可对抗凋亡，有望增加β细胞的量。综上所述，EXf作为肠降糖素的可替代多肽，在体内外均保留了EX-4的生物学活性，具有用于治疗糖尿病的潜在价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引言

第一部分 EXf抗糖尿病作用的药效学研究

前言

材料和方法

结果

1.EXf对正常小鼠口服葡萄糖负荷后血糖升高影响的量效关系

2.Exf对正常小鼠空腹血糖影响的时效关系

3.EXf对正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后Ⅰ相胰岛素分泌的影响

4.EXf对正常小鼠胃肠蠕动的影响

5.EXf对肥胖性胰岛素抵抗MSG小鼠血糖的影响

6.EXf对肥胖性胰岛素抵抗MSG小鼠口服葡萄糖负荷后血糖升高的影响

7.EXf对自发性2型糖尿病KKAy小鼠血糖的影响

8.EXf对自发性2型糖尿病KKAy小鼠口服葡萄糖负荷后血胰岛素水平的影响

9.EXf长期给药对2型糖尿病KKAy小鼠血糖的影响

10.EXf对四氧嘧啶高血糖小鼠血糖的影响

11.EXf长期给药对四氧嘧啶高血糖小鼠血糖的影响

小结

讨论

参考文献

第二部分 EXf对RIP1-CRE调控的转录活性的影响

前言

材料和方法

结果

1.RT-PCR结果

2.EXf对NIT-1细胞内cAMP含量的影响

3.peak12 RIP1-CRE GFP质粒鉴定

4.EXf对PIR1-CRE调控的转录活性的影响

5.GLP-1R的阻断剂exendin(9-39)对EXf转录调控作用的影响

6.PKA特异性抑制剂H89对EXf转录调控作用的影响

小结

讨论

参考文献

第三部分 EXf对NIT-1β细胞凋亡的影响及其机制的初步研究

前言

材料和方法

结果

1.EXf对Act D作用下NIT-1细胞活力的影响

2.Exf对H2O2作用下NIT-1细胞活力的影响

3.EXf对Act D诱导的NIT-1细胞凋亡的影响

4.EXf对100 μM H2O2诱导的NIT-1细胞凋亡的影响

5.EXf对200 μM H2O2诱导的NIT-1细胞凋亡的影响

小结

讨论

参考文献

全文总结

综述 新型糖尿病治疗药物Exendin-4的研究进展

个人简历

致谢