位于microRNA结合位点的基因多态与心脑血管疾病的相关性研究

摘要

心脑血管病是当今威胁人类健康的严重疾病之一。据最新的统计资料显示：在我国，心脑血管病是仅次于癌症的第二大致死疾病。脑卒中是心脑血管疾病主要类型之一，存在着明显三高(发病率高、致残率高、死亡率高)现象。引起脑卒中的原因众多，如高龄、吸烟、饮酒、高血压、高血脂、高血糖、心脏病、凝血机制障碍等，此外许多证据表明遗传因素在脑卒中的发病中有显著作用。寻找脑卒中的致病基因，从分子水平揭示脑卒中的发病机理，可为及早发现脑卒中的危险人群、预防脑卒中的发生提供帮助。 脑卒中是一种复杂疾病，发病过程涉及动脉粥样硬化病变。在动脉粥样硬化和动脉疾病的病理生理学过程中，血管发生是研究的热点。血管生成素-1(Angiopoietinl，ANGPT1)是一种特异作用于血管内皮细胞的生长因子，是酪氨酸激酶受体Tie-2的特异性配体。血管生成素-1在血管发生过程中起到了重要作用，它可以促进血管重塑、成熟、阻止内皮细胞凋亡，具有维持血管的完整性，促进血管损伤修复的功能。血管生成素-1的功能提示我们，任何影响其表达的基因多态性，都可能会与血管性疾病相关。通过对文献和数据库的查询，我们发现，血管生成素-1的3’-UTR区域存在SNP+1602 A/T，该位点被预测位于microRNA的结合识别区域，可能会影响microRNA与mRNA的结合。因此我们假设，+1602A/T可以影响血管生成素-1的表达，可能与脑卒中相关。 为了证明我们的假设，我们设计了荧光素酶报告系统实验，通过检测荧光素酶的表达来验证SNP是否影响基因表达。首先我们构建了含有SNP的荧光素酶质粒，然后与micorRNA或者对照一起共转染培养细胞，最后通过双荧光素酶检测来确定基因表达的情况。 实验结果证实：在microRNA存在的条件下，与SNP位点为T的荧光素酶质粒相比，SNP位点为A的荧光素酶质粒表达下降超过50％(P<0.01)。而在对照或者空白条件下，无论携带哪一种SNP位点，荧光素酶的表达均不发生改变。这说明microRNA可以通过识别不同的SNP对表达进行调控。 在验证了SNP的功能以后，我们进一步采用病例对照的研究方法，以两个独立的中国汉族样本为研究对象，探讨了血管生成素-1的SNP+1602 A/T在脑卒中患者各个亚型和正常对照中的分布，检测SNP是否与脑卒中相关。基因型鉴定采用聚合酶链反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)。基因型频率的分布符合Hardy-Weinberg平衡。 在第一个研究人群中，共计有脑梗患者803例，腔梗患者499例，出血性脑卒中患者489例，正常对照1843例进行了基因分型，各组间年龄、性别相匹配。结果显示：在正常对照中该基因分布为AA型31.9％、AT型48.5％、TT型19.6％；等位基因A和T的频率分别为0.561和0.439。在脑梗患者组中该基因分布为AA型34.9％、AT型46.9％、TT型18.2％；等位基因A和T的频率分别为0.583和0.417。与对照组相比，脑梗患者组中三种基因型分布没有显著性差异。在腔梗患者组中该基因分布为AA型39.5％、AT型48.3％、TT型12.2％；等位基因A和T的频率分别为0.636和0.364。与对照组相比，腔梗患者组中AA型和TT型分布存在显著性差异(P<0.01)。在出血性脑卒中组中该基因分布为AA型41.1％、AT型49.1％、TT型9.8％；等位基因A和T的分布频率分别为0.656和0.344。与对照组相比，出血性脑卒中组中AA型和TT型分布存在显著性差异(P<0.01)。Logistic回归分析结果证明：在校正了传统危险因素以后，血管生成素-1的+1602 AA基因型是引起出血性脑卒中的独立危险因素(P<0.01)。 在第二个研究人群中，共计有缺血性脑卒中患者238例，出血性脑卒中患者157例，正常对照790例进行了基因分型，各组间年龄、性别相匹配。结果显示：在正常对照中该基因分布为AA型32.9％、AT型47.8％、TT型19.3％；等位基因A和T的频率分别为0.568和0.432。在缺血性脑卒中组中该基因分布为AA型40.8％、AT型48.7％、TT型10.5‰等位基因A和T的频率分别为0.595和0.405。与对照组相比，AA型和TT型分布存在显著性差异(P<0.01)。在出血性脑卒中组中该基因分布为AA型43.3％、AT型47.1％、TT型9.6％；等位基因A和T的频率分别为0.669和0.331。与对照组相比，AA型和TT型分布存在显著性差异(P<0.01)。Logistic回归分析结果证明：在校正了传统危险因素以后，血管生成素-1的+1602AA基因型是引起缺血性脑卒中的独立危险因素(P=0.047)；同时血管生成素-1的+1602 AA基因型也是引起出血性脑卒中的独立危险因素(P<0.01)。 通过分析两个独立样本的研究结果，确认血管生成素-1的+1602 AA基因型可以增加出血性脑卒中的发病风险，但对于缺血性脑卒中的发病影响尚存在不同的结果，需要进一步研究。 本研究选择血管生成素-l的SNP+1602 A/T作为研究对象，研究SNP的功能以及与脑卒中的相关性。结果显示发现SNP+1602 A/T可以通过影响microRNA与mRNA的结合来影响血管生成素-1的表达。进一步的病例对照研究则显示+1602 AA基因型与出血性脑卒中明显相关，可以增加发病风险。这一发现可以用于开发新的检测方法，以便及早发现脑卒中的危险人群、预防脑卒中的发生。同时，这一发现也为治疗脑卒中提供了新的治疗靶点和思路。

目录

论文说明：缩略语表

第一部分 血管生成素-1基因多态性与出血性脑卒中相关

前言

实验材料及方法

1.主要仪器设备

2.主要试剂

3.研究对象

4.实验方法

实验结果

1.生物信息学分析结果

2.荧光素酶报告系统实验结果

3.PCR-LDR基因分型结果

4.病例对照研究结果

讨论

参考文献

第二部分 血管紧张素Ⅱ1型受体基因多态性与冠心病发病相关

前言

材料和方法

1.实验仪器

2.主要试剂

3.研究对象

4.实验方法

实验结果

1.病例和对照的基本临床资料

2.SNP A1166C位点多态性的人群分布

3.多因素Logistic回归分析结果

讨论

参考文献

综述一：MicroRNA与心血管生物学

综述二：血管生成素-1的血管保护功能及其信号通路

个人简历

致谢