高效表达重组HIV-1膜蛋白gp41及其在尿液检测中的应用

摘要

人获得性免疫缺陷综合症(AcquiredImmunodeficiencySyndrome，AIDS)，简称艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)引起的。自1983年中国出现首例HIV感染者至2007年10月底，中国累计报告艾滋病病毒感染者223501例，其中艾滋病病人62838例，死亡报告22205人。尽管经过20多年的研究，在HIV基础研究和预防治疗方面取得了较大进展，但是现在仍然没有彻底治愈AIDS的手段和令人满意的疫苗。目前控制HIV流行的主要方法是仍然是行为干预。因此，及早发现HIV感染病例对控制HIV流行起着举足轻重的作用。 HIV感染人体后，患者体内可产生针对HIV结构蛋白的特异性抗体，包括核心蛋白(P24、P17)；膜蛋白(HIV—1：Gp160、Gp120、Gp41；HIV—2：Gp140、Gp105、Gp36)以及病毒酶蛋白(P66、P31)的抗体[3，4]。其中外膜蛋白的抗体在病人一经产生就一直维持较高水平，因此，检测HIV—1膜蛋白的抗体，特别是gp41的抗体是判断是否感染HIV的标准之一。 常规HIV检测通常是以血液为检测对象，近年来以尿液、口腔渗出液为样本的HIV检测试剂逐渐受到关注。与血液检测试剂相比，这些检测试剂具有无创、无传染性等优点，在快速检测、研究同性恋等特定人群的HIV感染情况等领域得到了一定程度的应用。与血液检测试剂相比，因为尿液中的HIV特异性抗体浓度低，尿液HIV检测试剂对使用的抗原的质量要求更高。 本文以研制高质量HIV—1gp41诊断用抗原，制备HIV—1尿液检测试剂为目的，包括如下几个方面的内容： 1、重组gp41的基因优化及原核表达质粒的构建：在本室保存的HIV—1gp41表达质粒pGEX—5X—1—rgp41的基础上，用长引物多聚酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)法对gp41基因上游80bp进行大肠杆菌偏爱密码子优化，经过2轮PCR反应完成了基因优化并在基因上下游引入了酶切位点；然后将优化后的基因分别插入到原核表达载体pTXB、pET32a、pET22b中，构建原核表达质粒。 2、重组gp41的表达和纯化：分别将上述构建的原核表达质粒进行表达筛选；最终选用pET22b—mgp41进行大量表达和纯化，使用破菌、洗涤包涵体、金属螫合层析和分子筛层析等步骤纯化重组Gp41，最终得到的重组Gp41纯度大于95％。 3、重组Gp41大量发酵的工艺摸索：使用小型发酵罐对重组表达菌的大量发酵工艺进行了摸索，通过优化细菌生长条件，2.5L的培养物经过8小时的培养和诱导表达最终可以得到120g湿菌，目标蛋白的表达量达到25％以上。 4、尿液HIV—1抗体检测方法的初步建立和样品考核：使用本研究中制备的重组Gp41抗原，制备尿液HIV—1抗体检测试剂盒，并用临床样本对试剂盒进行了样品考核。考核结果显示，本研究建立的HIV—1抗体尿液检测方法的灵敏度和特异性分别达到了100％和98.52％，可以满足HIV—1初筛实验的要求。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分 重组HIV-1 gp41的基因优化及原核表达质粒的构建

材料和方法

(一)实验材料

(二)实验方法

结果

(一)基因优化结果

(二)第一轮PCR结果

(三)第二轮PCR结果

讨论

第二部分 重组gP41的表达和纯化

实验部分

(一)实验材料

(二)实验方法

结果

(一)构建和鉴定表达载体结果

(二)表达载体的小量表达和鉴定结果

(三)Gp41的大量表达并分析目标蛋白的存在状态结果

(四) 重组蛋白Gp41的纯化结果

讨论

第三部分 Gp41大量发酵的工艺摸索

实验部分

(一)实验材料

(二)实验方法

结果

(一)以高浓度肉汤培养基为基础培养基的发酵条件摸索

(二)以改良高浓度肉汤培养基为基础培养基的发酵结果

讨论

第四部分 HIV-1尿液抗体ELISA检测试剂盒的初步建立和应用

实验部分

(一)实验材料

(二)实验方法

结果

(一)尿液HIV-1抗体检测方法的初步建立

(二)HIV-1尿液抗体ELISA检测方法的初步应用结果

讨论

综述 HIV感染的诊断方法研究进展

参考文献

附录

致谢