上皮来源肿瘤中TGF-β和EGFR信号转导通路相互作用关系研究

摘要

表皮生长因子受体(EGFR)信号转导通路和转化生长因子p(TGF-β)信号转导通路是调节肿瘤发生发展的关键因素。上皮来源的恶性肿瘤中常伴随有EGFR的过表达。转化生长因子(TGF-β)是一种多功能多肤类生长因子，TGF-β及其信号转导通路对肿瘤的发生发展起重要的调节作用，我们在研究以EGFR为靶点的抗肿瘤药时发现，当EGFR活性被抑制后，试验动物的肺部出现了不同程度的纤维化，而TGF-β正是介导多种器官纤维化的重要介质，由此提示我们，在上皮来源的肿瘤中这两种信号转导通路可能存在着一定的作用关系。 TGF-β1蛋白对上皮来源的肿瘤细胞具有生长抑制作用:当在培养的人肺腺癌细胞A549中加入TGF-β1蛋白时，A549的增殖受到了明显的抑制，且出现了形态学上的变化，其外观更类似于成纤维细胞。TGF-β1蛋白对上皮来源的肿瘤细胞中EGFR信号转导通路具有抑制作用，当给予人表皮癌细胞 A431和人卵巢癌细胞SKOV3以TGF-β1蛋白刺激时，EGFR信号通路相关蛋白EGFR, ERK和AKT出现了不同程度的表达抑制。TGF-β信号转导通路下游Smad2/3蛋白与ERK蛋白具有直接的作用关系，我们通过免疫沉淀法观察到了A431细胞中Smad2/3和ERK蛋白一起沉淀下来，并且当在A431细胞给予TGF-β蛋白刺激时，随Smad2/3沉淀的ERK蛋白量增多。以上结果表明，在上皮来源的肿瘤中EGFR和TGF-β信号传导通路存在着相互制约的作用关系，TGF-β配体蛋白能抑制EGFR信号转导通路的功能，并且TGF-β下游信号蛋白Smad2/3能与ERK蛋白直接作用，提示EGFR和TGF-β信号传导通路的相互制约关系可能在于Smad2/3与ERK蛋白的直接作用。 TGF-β对于肿瘤的作用也可以归纳为由多种细胞因子介导的肿瘤微环境对肿瘤生长的影响，是一种多因素多条件的复杂作用，成纤维细胞是这些调控因子中的关键因素。我们采用同组织来源的肿瘤细胞和成纤维细胞的共培养模型来观察不同培养比例条件下对肿瘤细胞生长的影响以及在共培养条件下EGFR和TGF-β信号传导通路的作用关系。研究表明，在体外共培养条件下当人肺腺癌细胞A549和人胚肺成纤维细胞HELF以2:3的比例混合时，共培养体系总体细胞的生长、肿瘤细胞集落形成能力都受到了最大程度的抑制，在此条件下，细胞培养液中TGF-β1蛋白的含量最高，并且由间接免疫荧光试验表明此条件下的EGFR的活性也相对较低，提示这种抑制作用可能来源于EGFR和TGF-β信号传导通路的拮抗关系。在体内共培养条件下，随着共同与小鼠Lewis肺癌细胞接种的小鼠上皮成纤维细胞的增加，Lewis肺癌荷瘤率降低，并且瘤重受到了一定程度的抑制;免疫组化试验结果发现，随着共同接种的小鼠上皮成纤维细胞的增加，肿瘤组织中TGF-β1表达量增加，EGFR信号转导通路相关蛋白表达有一定程度的降低，以上结果提示，体内共培养模型的抑制作用也可能来源于EGFR和TGF-β信号传导通路的拮抗关系。综上所述上皮来源的肿瘤中存在着EGFR和TGF-β信号传导通路的拮抗关系，TGF-β信号可能通过其配体，下游Smad2l3蛋白产生对EGFR信号通路的干扰。但是这是一种多种因素决定的复杂作用，大量的文献数据表明在不同来源的、不同发展程度的肿瘤中存在着不同程度亦或是相反的作用关系。本研究探索和发现了TGF-β与EGFR信号转导通路在上皮来源的肿瘤中的干扰及机制，初探了成纤维细胞介导的肿瘤微环境与肿瘤发生发展的关系及其内在的TGF-β的作用，将为探索更为安全有效的肿瘤治疗手段提供理论依据和实验数据。

目录

第一部分 上皮来源肿瘤中TGF-β和EGFR信号转导通路相互作用关系研究

英文缩略词

前言

实验材料

实验方法

1.细胞培养及形态观察

2.细胞生长曲线的绘制

3.体外细胞共培养模型

4.体内细胞共接种模型

5.Western Blot杂交分析相关蛋白的表达

6.免疫组化法检测肿瘤组织中EGFR、pEGFR.、ERK、pERK和TGF-β 1的表达

7.间接免疫荧光法观察人TGF-β1蛋白对肿瘤细胞EGFR蛋白磷酸化水平的影响

8.免疫共沉淀技术观察肿瘤细胞内蛋白质相互作用

9.统计学处理

实验结果

1.TGF-β1对人肿瘤细胞形态和增殖的影响

2.TGF-β1对肿瘤细胞EGFR信号通路相关蛋白功能的影响及TGF-β与EGFR信号通路相互作用关系的初步探讨

3.同组织来源的成纤维细胞和肿瘤细胞体外共培养模型

4.同组织来源的成纤维细胞和肿瘤细胞体内共接种模型

结论

讨论

第一部分 参考文献

第二部分 新型紫杉烷类化合物Syl611和NBP071逆转肿瘤多药耐药活性及机理研究

英文缩略词

前言

实验材料

实验方法

1.MTT法测定肿瘤细胞存活率

2.AO/EB双染色检测细胞凋亡

3.流式细胞术分析逆转剂对细胞周期分布的影响

4.Western Blot杂交分析相关蛋白的表达

5.RT-PCR分析药泵基因转录表达

6.Rhodamine123蓄积试验

7.HPLC检测细胞内Paclitaxel的浓度

8.Caco-2单层细胞模型检测逆转剂对Paclitaxel跨膜的影响

实验结果

1.紫杉烷类化合物多药耐药逆转活性筛选及细胞毒性检测

2.AO/EB双染色法检测细胞凋亡

3.Syl611和NBP071对耐药细胞株A549/Paclitaxel和KB/V细胞周期分布的影响

4.Syl611和NBP071对A549/Paclitaxel中3种膜转运蛋白mRNA表达的影响

5.Syl611和NBP071对耐药肿瘤细胞中膜转运蛋白P-gp表达的影响

6.Syl611和NBP071对肿瘤细胞内Rhodamine123蓄积的影响

7.Syl611对耐药细胞株内Paclitaxel含量的影响

8.Syl611对Paclitaxel在Caco-2单层细胞模型中跨膜转运能力的影响

结论

讨论

第二部分参考文献

第一部分论文综述

参考文献

第二部分论文综述

参考文献

致谢

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