长期冻存后同种异体骨髓基质干细胞修复颅骨标准骨缺损的实验研究

摘要

目的：建立可靠、纯度高的犬骨髓基质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs）的分离纯化方法，观察其在体外扩增、成骨分化的能力。并进一步探索和评估：（1）长期冻存后的BMSCs的成骨分化能力；（2）同种异体BMSCs修复颅骨标准骨缺损的能力；（3）同种异体BMSCs移植是否引起明显的免疫排斥反应。旨在建立随用随取的同种异体BMSCs库，解决骨组织工程种子细胞的来源问题，促进骨组织工程早日在临床上广泛应用。
　　 方法：采用1.077g/ml Ficoll分离液，密度梯度离心法分离Beagle犬骨髓得到BMSCs，体外培养、扩增并用成骨条件培养液进行成骨诱导，进行碱性磷酸酶、茜素红染色和OPN、OCN、Ⅰ型胶原免疫细胞化学或免疫荧光染色。将大量扩增且成骨诱导后的BMSCs在液氮中冷冻保存6个月，复苏后接种于β-TCP支架上共培养，构建BMSCs/TCP复合物。在10只平均体重为11.9kg的成年Beagle犬颅骨上分别制造左右两个直径为20mm的标准骨缺损，分别为实验侧和对照侧。实验动物共分为三组，分别为同种异体组、自体组和空白组。同种异体组接种的同种异体BMSCs来自于自体组的2只Beagle犬骨髓。自体组接种的BMSCs来自于自体组的2只Beagle犬各自本身，即为相同来源的BMSCs，其分离、纯化、成骨诱导后冻存、复苏、共培养及移植的方法在各组之间完全一致。其中6只为同种异体组，实验侧（左）应用成骨诱导后的同种异体BMSCs/β-TCP复合物修复，对照侧（右）单独应用β-TCP修复。另外2只犬（提供骨髓犬）为自体组，实验侧（左）应用成骨诱导后的自体BMSCs/β-TCP复合物修复，对照侧（右）单独应用β-TCP修复。其余2只犬为空白组，实验侧（左）单独应用β-TCP修复，对照侧（右）为空白对照，不接种任何材料。
　　 应用1-0号丝线封闭切口。采用组织学和影像学方法评估术后16和24周的修复情况。同时监测外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的变化，对术后全身免疫反应进行评估。
　　 结果：采用1.077g/ml Ficoll液可获得纯度较高的BMSCs，细胞生长良好，平均倍增时间为24h，经成骨诱导培养后可定向分化为成骨细胞。应用成骨诱导后的冻存半年的同种异体BMSCs复合β-TCP修复Beagle犬颅骨标准骨缺损，无明显不良反应，所有动物术后均存活，无感染发生。16周后初步的组织学和影像学检查表明，同种异体组（6例）的成骨情况良好。免疫学分析表明CD4+和CD8+T细胞数量以及CD4+/CD8+比值在三组Beagle犬中无显著性差异（p<0.05）。
　　 结论：采用1.077g/ml Ficoll液能有效地分离Beagle犬骨髓中的BMSCs，通过成骨诱导可分化为成骨细胞，从而为骨缺损的修复提供理想的组织工程种子细胞。长期冻存的同种异体BMSCs复苏后与β-TCP支架共培养，植入Beagle犬颅骨标准骨缺损中，在没有使用免疫抑制的情况下可以很好的修复骨缺损，没有明显的免疫排斥反应发生。

目录

文摘

英文文摘

综述一

综述二

前 言

第一部分 犬BMSCs的分离纯化和成骨诱导培养

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 长期冻存后同种异体BMSCs修复颅骨标准骨缺损

前言

材料与方法

结果

讨论

全文结论

参考文献

附录一 英文缩略词表

附录二 略图

附录三 略表

致谢

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