钙离子载体A23187对脐血来源EPC作用及应用蛋白质芯片检测蛋白质表达差异的研究

摘要

研究背景：组织工程血管以及组织工程化组织的血管化因目前内皮种子细胞扩增能力和生物活力的不足而受到限制。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是内皮细胞的前体细胞。并可被转移至外周血，参与缺血组织的血管重建和血管的内膜化，因此EPCs有望成为今后组织工程内皮种子细胞的重要来源。为此，有关EPCs的体外诱导培养、扩增和细胞增殖、凋亡的调控亟待深入研究，在细胞行为调控中，钙离子是细胞生物行为的重要调控因子，当细胞内钙离子稳态失衡时，会导致多种细胞异常行为发生，从而引发疾病。钙离子载体A23187是一种高度选择性的钙离子载体，能与Ca2+形成稳定的复合物，使胞外的Ca2+透过细胞膜，生理性或人为性地提高胞浆游离钙水平，有效增加细胞内Ca2+浓度，增高的Ca2+作为第二信使可促使蛋白激酶C（PKC）和其他钙依赖性蛋白激酶活化，并催化细胞内多种蛋白质磷酸化，从而启动淋巴细胞活化、增殖。此外，A23187还是氧化磷酸化的解偶联体，抑制线粒体ATP酶的活性，影响细胞代谢水平。
　　 研究目的第一部分研究目的在于建立体外培养脐血来源内皮祖细胞的培养体系，包括脐带血采集、单个核细胞分离、内皮祖细胞诱导培养、内皮祖细胞生长特性和表型分析鉴定。第二部分研究目的在于利用移动性钙离子载体A23187作用于内皮祖细胞，观察其对内皮祖细胞的作用影响；以表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（surfaceenhanced laser desorption/ionization-time of flight-massspectrometry，SELDI-TOF-MS）技术分析A23187作用后的内皮祖细胞细胞内钙离子浓度变化及其对细胞表型和细胞蛋白质表达谱的影响，探讨不同浓度A23187及引起的相应细胞内钙离子浓度变化对内皮祖细胞的调控机制和作用，为内皮祖细胞调控机制和临床应用提供研究依据。
　　 研究方法在第一部分中，经无菌采集后的脐带血，在2小时内经密度梯度离心获得单个核细胞，以本室已建立的内皮祖细胞培养体系培养，从脐血获得的单个核细胞接种4天后，分别选取贴壁细胞和悬浮细胞进行培养至第12天后，观察两种方法所获得细胞的形态及数量。对悬浮细胞进行培养，免疫细胞化学和流式细胞术对培养7天后的细胞进行内皮祖细胞相关细胞表型CD34、CD133、vWF、CD146，CD144鉴定，培养过程中，观察细胞生长状况并测定细胞生长曲线。在第二部分中，钙离子载体A23187以0，1，3，5μmol/L作用于培养至第七天的内皮祖细胞，作用24小时，后流式细胞术检测A23187不同浓度作用下细胞内钙离子浓度变化，并且利用流式细胞术检测不同浓度A23187作用下P1H12（CD146）的表达量。采用SELDI蛋白质芯片检测不同A23187浓度作用下蛋白质差异表达情况：1.Western-IP裂解液进行蛋白质提取并利用BCA法测定蛋白浓度；2.蛋白活化点样；3.芯片检测；4.数据处理与分析。
　　 研究结果第一部分中，经观察筛选，发现从脐血获得的单个核细胞接种4天后，分别选取贴壁细胞和悬浮细胞进行培养至第12天后，观察两种方法所获得细胞的形态及数量。发现选取贴壁细胞进行培养，细胞总数较少为301±205，并且无梭形样内皮祖细胞出现；相反，选取悬浮细胞进行培养，至第12天时，细胞数量达708±142（P<0.05），并且出现梭形样内皮祖细胞。故此，本研究选用悬浮细胞进行诱导培养，其接种后前5天为生长的潜伏期，细胞开始贴壁，无明显扩增。第6天平均每个视野下细胞数目为287±45；第9天细胞数为282±46；第12天开始，细胞进入对数生长期，细胞数为805±67（P<0.05，与第6天的细胞相比）；第19天细胞继续增殖，细胞数为1115±182（P<0.05，与第6天的细胞相比）；第23天时，细胞进入凋亡期，数量明显减少，为265±61（P<0.05，与第6天的细胞相比）。vWF，CD146，CD144表达阳性。流式细胞术结果表明，梭形样细胞群体中，CD34阳性率为88.98％±5.15％（P<0.05），CD133阳性率为1.20％±1.44％（P<0.05）。第二部分中，经SELDI技术检测A23187不同浓度组，结果显示共有20个差异表达蛋白，其中12个高表达，8个为低表达（P<0.05）。并且内皮祖细胞CD146阳性率呈A23187浓度依赖性降低，并发现钙离子载体A23187在浓度高至10μmol/L时，有显著促进内皮祖细胞凋亡作用。
　　 研究结论经本研究建立的内皮祖细胞培养体系，能够自脐带血来源的单个核细胞成功诱导培养出具内皮祖细胞形态特征的细胞，经细胞表型鉴定为内皮祖细胞。对上述内皮祖细胞以钙离子载体A23187作用，发现A23187在低浓度时，抑制内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化；高浓度时，凋亡细胞数目增加，有浓度依赖性促进内皮祖细胞凋亡，并且具有抑制内皮祖细胞向内皮细胞分化的作用。
　　 待研究工作：对本研究中以SELDI技术检出的差异蛋白质点进行进一步分析，采用二维凝胶电泳及质谱法对于差异表达蛋白进行鉴定。

目录

文摘

英文文摘

第一部分：内皮祖细胞（EPC）的体外培养

前 言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

需要进一步进行的研究

参考文献

第二部分：SELDI芯片分析钙离子载体A23187对于内皮祖细胞蛋白表达的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

需要进一步进行的研究

参考文献

文献综述：内皮祖细胞研究进展概述

参考文献

致谢

个人简历

附：已发表论文及大会交流论文摘要