褪黑素对人脐血来源EPC作用及应用蛋白质芯片检测蛋白质表达差异研究

摘要

目的：内皮祖细胞（endothelial progenitot cells，EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞，其在组织缺血后的血管发生和血管新生中起着重要作用。本研究旨在建立体外培养脐血来源内皮祖细胞的培养体系及褪黑素对内皮祖细胞的干预影响；探讨以SELDI芯片技术进行细胞标本蛋白分析的最适方法及条件，筛选褪黑素干预后EPC蛋白表达差异；并通过Tricine-SDS-PAGE电泳分离差异蛋白，FT-MS分析鉴定差异蛋白。从而探讨褪黑素对EPC的作用及其机制，建立从细胞培养及药物干预到蛋白质组学研究的方法体系，并为血管新生及肿瘤抑制调控提供研究依据。
　　 方法：脐带血经密度梯度离心获得单个核细胞，建立本实验室的EPCs培养体系培养，以免疫细胞化学和流式细胞术对经本体系培养7天后的单个核细胞进行内皮祖细胞表型CD34、CD133、vWF、CD146，CD144鉴定。对培养至7天的EPC进行低中高三个浓度组（1μM，5μM，10μM）褪黑素作用24h。后收集药物干预组、同期非药物干预对照组细胞，对细胞标本分别用超声裂解法，U9细胞裂解缓冲液配方和本研究建立的细胞裂解液法提取蛋白，以BCA法测定蛋白浓度；分别以磁珠活化后点样和生物芯片处理器使蛋白样品与芯片结合；并对提取蛋白进行检测，比较不同蛋白浓度梯度点样及WCX2，SAX2，IMAC-Cu，H50不同类型芯片捕获蛋白差异，最后以WCX2芯片筛选蛋白差异表达。对差异蛋白峰采用Tricine-SDS-PAGE体系分离差异蛋白，根据SELDI差异蛋白表达结果通过选取一53kDa左右差异峰蛋白做FT-MS分析鉴定，探讨差异蛋白点的鉴定。
　　 结果：细胞接种后前5天为生长的潜伏期，细胞开始贴壁，无明显扩增。第6天平均每个视野下细胞数目为287±45；第9天细胞数为282±46；第12天开始，细胞进入对数生长期，细胞数为805±67（P<0.05）；第19天细胞继续增殖，细胞数为1115±182（P<0.05）；第23天时，细胞进入凋亡期，数量明显减少，为265±61（P<0.05）。vWF，CD146，CD144表达阳性。流式细胞术结果表明，梭形样细胞群体中，CD34阳性率为88.98％±5.15％（P<0.05），CD133阳性率为1.20％±1.44％（P<0.05），VEGFR2阳性率为41.83％±3.23％（P<0.05）。药物干预24h后，光学显微镜下观察，低浓度（1μM）褪黑素能促进细胞生长，高浓度（10μM）褪黑素则对EPC有较强的抑制和促凋亡作用。相同培养条件细胞以上述三种蛋白提取方法获得的蛋白浓度分别为：0.25±0.034μg/μL，0.6±0.06μg/μL，1.02±0.077μg/μL；生物芯片处理器点样法操作简单，要求样本量较少，点样时间短；SELDI芯片蛋白质峰图谱能反映蛋白浓度情况；WCX2，SAX2，H50，IMAC-Cu芯片捕获的蛋白质种类有较大区别；在分子量1000～300000Da范围内，以WCX2芯片共检测到87个药物干预差异蛋白峰，其中17个差异呈趋势变化。通过Tricine-SDS-PAGE系统可获得分离蛋白条带，通过FT-MS分析鉴定，方法已建立，初步测试的分子量为53kDa左右的差异峰蛋白条带为α-微管蛋白。
　　 结论：利用本实验室的培养体系成功培养出内皮祖细胞。镜下观察，低浓度褪黑素能促进EPC生长和增殖，高浓度抑制其生长。三种蛋白提取方法比较，选用自配的细胞裂解液提取蛋白的浓度较高且更适于芯片研究；生物芯片处理器能较好的使蛋白与芯片结合；SELDI芯片不仅能准确的定位蛋白，也能较好的反应蛋白浓度关系；SELDI各芯片捕获蛋白类型不同，选择适宜芯片或联合运用芯片检测更易获得较理想蛋白差异表达结果。SELDI芯片检测到17个药物干预趋势差异表达蛋白峰，通过Tricine-SDS-PAGE，能够分离差异蛋白，并可通过FT-MS分析进行准确鉴定。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 单个核细胞的分离、诱导培养成内皮祖细胞及鉴定

研究背景

1.内皮祖细胞概述

2.内皮祖细胞研究进展

材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

实验结果

1.两种培养方法获得内皮祖细胞数量的比较

2.形态学观察

3.细胞生长曲线测定

4.免疫细胞化学鉴定内皮祖细胞

5.流式细胞术检测内皮祖细胞含量

讨论

第二部分 褪黑素对内皮祖细胞的干预及以蛋白质芯片进行差异表达蛋白分析和鉴定

研究背景

1.黑素研究进展

2.SELDI蛋白质芯片检测技术研究进展

材料和方法

1.溶液配制

2.实验方法

实验结果

1.药物干预后细胞形态学观察

2.不同方法BCA法测定蛋白浓度结果

3.SELDI进行细胞来源蛋白的分析方法研究

4.EPC梯度浓度褪黑素干预组与空白对照组蛋白表达差异

5.Tricine-SDS-PAGE分离差异蛋白

6.FT-MS分析差异蛋白质谱图

讨论

第三部分 下一步即将展开的工作

参考文献

已发表的文章

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