纳米材料PAMAM G3及甲型H1N1流感病毒导致小鼠急性肺损伤的致病机理研究

摘要

第一部分:
　　 纳米材料PAMAMG3诱导小鼠急性肺损伤的致病机理研究
　　 纳米材料PAMAMG3引起A549细胞自噬性死亡，并导致小鼠急性肺损伤
　　 作为一项重要的和新兴的产业，纳米技术正逐步从研究领域涉及到日常生产生活。然而，直到最近，人们才开始关注纳米材料对人体及环境的安全性问题。已经有研究称：纳米材料可以造成肺部的疾病或损伤，但其所导致的肺部损伤的分子机制却仍然没有被揭示出来。
　　 本文所研究的纳米材料是一种具有高度支化、对称、呈辐射状的大分子——聚酰胺-胺树枝状大分子纳米材料(PAMAMdendrimer)。它由中心核、内层重复的分支亚单位以及表面的功能基团组成。整代的PAMAM纳米材料表面的功能基团为氨基，半代的PAMAM纳米材料表面的功能基团为羧基。由于氨基带有正电荷，整代的PAMAM常被用作载体，递送DNA，进行细胞或生物体内表达。对于这些PAMAM材料生物安全性的研究甚少。
　　 本文中，我们测定了PAMAMG1～G8以及G3.5、G4.5、G5.5和G7.5对A549细胞的影响。发现从PAMAMG3到PAMAMG8均会引起A549细胞的死亡。而表面基团为阴离子的半代PAMAM对A549细胞的活性不会产生影响。我们对PAMAMG3引起的A549细胞死亡进行了分析，发现PAMAMG3不是通过凋亡通路引起的A549细胞死亡，而是引起细胞自噬性死亡。给予自噬的抑制剂3MA或是利用siRNA技术抑制自噬基因ATG6的表达，可以有效地缓解PAMAMG3引起的A549细胞死亡。同时，自噬性细胞死亡也在PAMAMG4、G5、G6、G7和G8引起的A549细胞死亡中扮演着重要角色。
　　 同时，我们对PAMAMG3引起的自噬性细胞死亡的信号通路进行了分析。发现PAMAMG3通过Akt-TSC2-mTOR的信号通路引起A549发生自噬性细胞死亡。
　　 此外，我们发现PAMAMG3会导致小鼠死亡，引起小鼠急性肺损伤。而自噬的抑制剂3MA有效地缓解PAMAMG3引起的小鼠死亡，改善小鼠的急性肺损伤程度。说明自噬在PAMAMG3引起的小鼠死亡中发挥着重要作用。
　　 第二部分:
　　 甲型H1N1流感病毒（BJ株）导致小鼠急性肺损伤的致病机理研究
　　 甲型H1N1流感病毒导致小鼠急性肺损伤的致病机理研究
　　 2009年3月，从美国和墨西哥流感样患者呼吸道标本中，鉴定出新的猪源性甲型H1N1流感病毒。该病毒可在人际间传播，已蔓延100多个国家、地区。人感染后的主要临床表现为急性呼吸道感染症状，部分患者病情进展迅速，继发急性呼吸窘迫综合征、肺出血、呼吸衰竭和多器官损伤，导致死亡。感染甲型H1N1流感病毒导致的急性呼吸系统损伤的致病机制尚不清楚。
　　 本研究通过建立甲型H1N1流感病毒感染的小鼠模型，揭示NF-κB信号的激活，可诱发炎症相关因子产生，形成细胞因子风暴（Cytokinestorm），在小鼠感染病毒后导致的急性肺损伤中发挥重要致病作用。
　　 通过检测小鼠的死亡率、肺组织湿干比、肺组织病理、支气管肺泡灌洗液中的炎症相关因子以及肺组织中单核巨噬细胞磷酸化NF-κB及IκB-α的表达等指标，比较不同流行株的甲型H1N1流感病毒对不同周龄、不同品系小鼠的致病性。
　　 结果：表明：与CA07株甲型H1N1流感病毒比较，BJ株对4周龄的C57BL/6小鼠具有更强的致肺损伤能力，其在小鼠肺组织中的复制能力也明显高于CA07株甲型H1N1流感病毒。
　　 感染甲型H1N1流感病毒BJ株的小鼠，在连续给予糖皮质激素地塞米松治疗后，其死亡率有明显降低，肺组织损伤也得到显著缓解，说明激素抑制了剧烈的炎症反应，降低了小鼠的急性肺损伤程度。
　　 上述结果的阐明，为了解甲型H1N1流感病毒导致的急性肺损伤致病机理，并临床上治疗甲型流感病毒导致的急性呼吸系统损伤提供了重要信息。

目录

图表目录

第一部分 纳米材料PAMAM G3诱导小鼠急性肺损伤的致病机理研究

前言

一、实验材料与方法

第一节 纳米材料PAMAM对人肺上皮细胞(A549细胞)的毒性

第二节 纳米材料PAMAM诱导人肺上皮细胞(A549细胞)自噬性死亡

第三节 纳米材料PAMAM G3激活Akt-TSC2-mTOR通路诱导人肺上度细胞(A549细胞)自噬性死亡

第四节 纳米材料PAMAM G3诱导自噬性细胞死亡致小鼠急性肺损伤

二、实验结果

第一节 纳米材料PAMAM对人肺上皮细胞(A549细胞)的毒性

第二节 纳米材料PAMAM诱导人肺上皮细胞(A549细胞)自噬性死亡

第三节 纳米材料PAMAM G3激活Akt-TSC2-mTOR通路诱导人肺上皮细胞(A549细胞)自噬性死亡

第四节 纳米材料PAMAM G3诱导自噬性细胞死亡致小鼠急性肺损伤

三、结论

四、讨论

五、参考文献

第二部分 甲型H1N1流感病毒(BJ株)导致小鼠急性肺损伤的致病机理研究

前言

一、实验材料与方法

第一节 甲型H1N1流感病毒的培养、浓缩

第二节 甲型H1N1流感病毒的血凝单位及50%培养组织感染剂量(TCID50)测定

第三节 甲型H1N1流感病毒感染小鼠及50%致死剂量(LD50)的测定

第四节 甲型H1N1流感病毒(BJ株)致4周龄C57 BL/6小鼠急性肺损伤模型的建立

第五节 不同株甲型H1N1流感病毒对4周龄C57 BL/6小鼠致病性比较

第六节 甲型H1N1流感病毒对不同品系,不同周龄小鼠致病性比较

第七节 药物治疗甲型H1N1流感病毒感染引起的小鼠急性肺损伤

二、实验结果

第二节 血凝单位及50%培养组织感染剂量TCID50测定

第三节 甲型H1N1流感病毒感染小鼠及50%致死剂量(LD50)的测定

第四节 甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染致4周龄C57 BL/6小鼠急性肺损伤模型的建立

第五节 甲型H1N1流感病毒(BJ株,CA07株)对4周龄C57 BL/6小鼠致病性比较

第六节 甲型H1N1流感病毒对不同种系,不同周龄小鼠致病性比较

第七节 药物治疗甲型H1N1流感病毒(BJ株)感染引起的小鼠急性肺损伤

三、结论

四、讨论

五、参考文献

综述

英文略语表

致谢

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