高效液相色谱测定血清胆固醇酯n-3脂肪酸指数

摘要

目的：
　　 建立一种简便、快速、精密的高效液相色谱（HPLC）测定血清胆固醇酯n-3脂肪酸指数（CEn-3指数）的方法，用于多不饱和脂肪酸（PUFA）摄入人群营养筛查，并研究CEn-3指数与心血管疾病危险因素的关系。
　　 方法：
　　 采集血液样品，凝血后离心分离血清，用氢氧化钠（NaOH）乙醇溶液水解血清甘油三酯（TG），乙酸终止水解反应，正己烷提取胆固醇和胆固醇酯（CE），HPLC分离脂质，紫外（205 nm）检测，计算n-3脂肪酸CE在所有CE中的百分比（CEn-3指数）。胆固醇二十碳五烯酸酯（20:5-CE）和二十二碳六烯酸酯（22:6-CE）用液相色谱串联质谱（LC/MS/MS）鉴定，各CE峰面积校正因子用测定相应组分胆固醇含量的方法确定，归一化法定量，各CE的百分含量用校正的CE摩尔百分比表示。征集106名健康北京居民，测量身高、体重、血压，用上述方法测定血清标本CE n-3指数，描述此范围的人群分布特征，用HPLC法测定FERHDL，用酶法测定血清总胆固醇（TC）和TG，用超速离心HPLC法测定HDL-C、HDL亚类胆固醇（HDL2-C和HDL3-C）、低密度脂蛋白（LDL）胆固醇（LDL-C）、LDL亚类胆固醇（LDLa-C和LDLb-C）和脂蛋白（a）胆固醇[Lp（a）-C]，分析CE n-3指数与其他指标的关系。
　　 结果：
　　 1.HPLC测定CE n-3指数的色谱条件为：采用Nova-Pak C18色谱柱（5μm，3.9mm×150mm）；流动相为乙腈-异丙醇-正己烷=55-50-15；紫外205nm检测；流速为1.2mL/min；进样50uL；色谱分析在6分钟内完成；且血清中n-3 CE与其他CE分离良好。
　　 2.影响CE n-3脂肪酸指数测定的TG用4mol/LNaOH的乙醇溶液水解30秒，可被去除，CE n-3指数预计比实际水平低约3％，对测定结果影响较小，出于实用考虑，可以作为去除TG的方法。
　　 3.比较两种提取溶剂对样品中各脂质的提取效率，结果显示一致，表明溶剂可以充分提取各脂质组分，在一定程度上可以保证测定结果的准确性。
　　 4.测定血清CE n-3指数的批内和总变异系数分别为0.36％～0.86％和0.65％～1.17％，远优于红细胞膜n-3指数的分析重现性（CV=4-7％）。
　　 5.测定106例北京居民血清CE n-3指数，全体指数略呈正偏态分布（偏度值=1.25，峰度值=1.70），中位数为0.98％（0.37％～2.40％）。n-3指数对数基本呈正态分布（偏度值=0.24，峰度值=0.27），均值为0.0037％，标准差为0.15％，95％分布区间为（-0.0248％，0.0322％）。性别组n-3指数分布与全体类似，女性和男性中位数分别为1.08％（0.60％～2.40％）和0.95％（0.37％～2.11％），女性明显高于男性（t=2.694，P=0.008）。相关分析结果显示，CE n=3指数与收缩压、TG和FERHDL显著正相关（P<0.05或0.01）；CE n-6/n-3与身高、TC、TG、LDL-C、LDLa-C、FERHDL和CE n-3指数显著负相关（P<0.05或0.01）；PUFA/MUFA与HDLC、HDL2-C、HDL3-C、LDL-C和LDLa-C显著正相关（P<0.05或0.01）；与年龄、体重、BMI、收缩压、TG和CE n-6/n-3显著负相关（P<0.05或0.01）。
　　 结论：
　　 1.建立了HPLC测定血清CE n-3指数的方法，该法简便、快速、精密、成本低，有望在营养监测和心血管病危险分析中发挥作用。
　　 2.测定了106名北京居民CE n-3指数，给出了此人群CE n-3指数的参考值及分布特征，并分析了该指标与一般体征指标及常规血脂指标的关系。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

引言

材料与方法

1 试剂和仪器

1.1 化学试剂

1.2 标本来源

1.3 仪器和材料

2 血清CE n-3脂肪酸指数的测定

2.1 血清样品的分离、储存及分析前准备

2.2 溶液的配制

2.3 血清TG水解及CE的提取

2.4 高效液相色谱（HPLC）分析

2.5 CE n-3脂肪酸指数的计算

3 CE组分的质谱鉴定

3.1 CE标准溶液配制

3.2 样品中CE组分的收集及分析前准备

3.3 质谱条件

3.4 质谱分析

4 校正因子（F）的测定及计算

4.1 胆固醇及CE组分收集

4.2 内标的加入

4.3 CE水解

4.4 游离胆固醇测定

4.5 HPLC分析

4.6 F值计算

5 方法学论证

6.106名北京居民CE n-3指数及心血管病危险因素指标测定

6.1 样本来源及储存

6.2 CE n-3指数测定

6.3 危险因素指标测定

7 统计分析

8 人群分析

研究过程与结果

1 n-3 CE测定的影响因素

1.1 正相色谱分离CE和TG

1.2 水解去除TG

1.3 水解条件的确定

2 提取系统的选择

3 液相色谱条件的选择和优化

3.1 流动相组成的选择和优化

3.2 检测波长的选择

4 定性研究-质谱鉴定CE组分

4.1 质谱条件的选择和优化

4.2 所有CE组分的鉴定

5 定量研究-归一化法定量

6 方法的精密度评价

7 人群分析

讨 论

结 论

参考文献

附 录

文献综述

参考文献

致 谢

个 人 简 历