PIH1介导SNF5在激活核糖体RNA基因转录的调控机制

摘要

染色质的修饰及其结构重塑是一个多分子参与的、多途径协同、高度复杂和有序完成的过程。它们也是真核基因在内外环境影响下引发的最重要的核内事件和基因起始转录的前提。染色质重塑复合物是依赖于ATP提供能量从而改变蛋白与DNA的结合状态，根据其ATP酶亚基的不同可以分为四类：SWI2/SNF2、ISWI、Mi-2/CHD、IN080/SWR1。与RNA聚合酶Ⅱ相关的人类SWI/SNF复合物中，除ATP酶亚基BRG1或BRM外，INI1/SNF5也是其中的核心亚基之一。而在核仁中与RNA聚合酶Ⅰ转录抑制相关的NoRC复合物则是依赖于ATP和组蛋白H4尾端的ISWI染色质重塑复合物。
　　 在哺乳动物细胞中，核糖体的形成是一个生物合成和能量消耗的过程。核糖体的生物合成和细胞所处能量环境和糖状态密切相关，核糖体的合成和rRNA的转录密不可分，而rRNA的转录合成又和能量代谢和环境变化相关。SNF5是ATP依赖的染色质重塑复合物SWI/SNF的核心亚基之一。SNF5被认为是一种抑癌基因，SNF5的突变或者缺失，可以导致早期胚胎致死或者诱发肿瘤，在一些相关肿瘤中都发现SNF5的不表达或者突变，如MRT、AT/RT等，但是关于SNF5的作用机制却并没有深入的研究。也没有人提出SNF5和rDNA的转录相关。本课题组研究发现PIH1是SNF5的结合蛋白，在酵母中PIH1的同源物NOP17参与pre-rRNA的剪切。
　　 染色质局部的、可逆性的改变对基因的选择性表达起关键作用，并且是当今表观遗传调控机制研究的核心内容之一。本论文以核糖体RNA（rDNA）基因为模型，研究了SNF5在高糖诱导条件下，对rDNA的转录激活机制，其中主要涉及组蛋白的乙酰化修饰和依赖于ATP的染色质重塑复合物的调控。
　　 我们通过体外GST-pulldown实验、体内免疫共沉淀（CoIP）实验以及免疫荧光实验证实SNF5和PIH1的相互作用，而且找到两者的具体结合部位。通过Northern组织膜杂交，确定PIH1组织分布的广泛性。
　　 我们采用荧光素酶双报告基因和real-time RT-PCR检测SNF5对rDNA的转录激活；利用染色质免疫共沉淀（ChIP）检测SNF5对rDNA启动子区的组蛋白的修饰影响。过表达SNF5增强rDNA启动子报告基因的活性和pre-rRNA的表达量，也增加了组蛋白乙酰化水平、降低组蛋白甲基化水平；相反，敲低SNF5降低rDNA启动子报告基因的活性和pre-rRNA的表达，也降低了组蛋白乙酰化水平、增加组蛋白甲基化水平。
　　 采用荧光素酶双报告基因和real-time RT-PCR检测系统和染色质免疫共沉淀（ChIP）技术，发现PIH1和SNF5具有相同的功能。进一步发现，删除与PIH1结合部位的SNF5删切体的过表达对rDNA的转录没有影响：在PIH1敲低的条件下，SNF5募集到rDNA启动子区的量明显减少；再者，在高糖诱导的rDNA转录的过程中，SNF5必需通过PIH1募集到rDNA的启动子区，起到桥梁的作用。
　　 rDNA启动子区异染色质状态的维持，依赖于NoRC的亚基之一Tip5的bromo结构域与乙酰化的组蛋白H4K16的结合。而我们通过ChIP实验发现，PIH1与Tip5竞争结合于组蛋白H4K16，从而激活rDNA转录。质谱和体外结合实验证明，PIH1和组蛋白H4特异结合，且H4K16是两者结合的关键的部位。同时，我们还发现PIH1和pol I的转录激活因子UBF结合，并且影响其在rDNA启动子区的募集，所以SNF5可能通过UBF激活转录。
　　 高糖诱导可以促进细胞增殖，在此过程中rDNA的转录明显增加。我们通过real-time RT-PCR和ChIP实验证明，SNF5高糖诱导下募集到rDNA启动子区的量明显增加；SNF5的敲低削弱了rDNA的转录；而且SNF5的作用依赖于PIH1与组蛋白H4的结合。
　　 本论文研究发现，SNF5可以激活PIH1依赖的rDNA的转录，PIH1可能通过与Tip5竞争性的结合于组蛋白H4K16，抑制NoRC的募集，从而激活rDNA转录，在细胞增殖中发挥关键作用。
　　 关于SNF5的研究很多，但是其作用机制并不太清楚。我们的研究第一次发现SNF5可以激活rDNA的转录，且激活机制依赖于PIH1与Tip5竞争性的结合于组蛋白H4K16。

目录

文摘

英文文摘

缩写词表

前言

材料与方法

结果

一.染色质重塑复合物亚基SNF5的结合蛋白PIH1被发现

1、体内体外验证PIH1和SNF5结合

2、PIH1和SNF5共定位于细胞核内

3、PIH1的组织分布

二.确定SNF5和PIH1的具体结合部位

1、SNF5和PIH1表达质粒的删切以及在细胞中的表达

2、SNF5和PIH1的具体结合部位的确定

三.PIH1功能的初步鉴定

1、PIH1抑制SNF5的降解

2、PIH1对细胞周期的影响

3、PIH1以及SNF5和核糖体RNA基因（rDNA）的转录相关

四.PIH1和SNF5促进rDNA的转录

1、人rDNA启动子报告基因的构建

2、PIH1和SNF5促进rDNA的转录

3、PIH1和SNF5改变rDNA启动子区的染色质状态

4、SNF5的细胞定位

五.PIH1为SNF5激活rDNA转录所必需

六.SNF5通过PIH1激活rDNA转录的机制的探索

1、PIH1293T稳定表达细胞系的构建和验证

2、PIH1的双标签纯化、电泳和银染、质谱分析

3、体内体外验证组蛋白H4和PIH1结合

4、组蛋白H4N端氨基酸特别是16位赖氨酸H4K16在H4和PIH1相互作用中起关键作用

5、SNF5或者PIH1的敲低影响相关因子在rDNA启动子区的募集

6、PIH1激活rDNA转录通过UBF起作用

七.PIH1在高糖诱导rDNA转录中的功能

讨论

小结

文献综述

参考文献

致谢

个人简历